中国农学通报 2013,29(26):25-30 Chinese Agricultural Science Bulletin 0 引言 甲砜霉素(Thiamphenicol, TAP)为氯霉素类衍生 物, 又名甲砜氯霉素、 硫霉素(Thienamycin), 具有广谱 抗微生物作用, 对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有 较强的抑制作用, 在水产养殖中对疾病的控制和治疗 能够起到显著的效果.然而, 水产品中药物残留严重 的威胁着食用者的健康.中国和欧盟规定了甲砜霉素 的最高残留限量(MRLs)为50 μg/kg[1-2] .因此, 通过对 甲砜霉素在水产品中残留消除规律的研究, 进而制定 该药的休药期, 对于促进科学合理的使用兽药, 维护消 基金项目: 行业专项 "渔药使用风险评估及其控制技术研究与示范" (201203085); 第一作者简介: 韩冰, 男, 1989年出生, 山东德州人, 硕士, 主要从事鱼类疾病研究.通信地址: 150070 黑龙江省哈尔滨市道里区河松街232号, Tel: 0451-84861322, E-mail: h_bing1022@163.com. 通讯作者: 卢彤岩, 女, 1967年出生, 黑龙江人, 研究员, 主要从事水产动物病害的相关研究.通信地址: 150070 黑龙江省哈尔滨市道里区河松街232 号, Tel: 0451-84861322, E-mail: lutongyan@hotmail.com. 收稿日期: 2013-01-10, 修回日期: 2013-04-22. 甲砜霉素在鲤鱼及鲫鱼体内的残留研究 韩冰1,2 , 杨洪波1,2 , 王荻1 , 卢彤岩1 (1 中国水产科学研究院/黑龙江水产研究所, 哈尔滨 150070; 2 上海海洋大学水产与生命学院, 上海 201306) 摘要: 本研究旨在分析甲砜霉素在鲤鱼和鲫鱼体内的残留消除规律并为制定休药期提供依据.按照 30 mg/kg的给药量对鲤鱼和鲫鱼连续口灌给药甲砜霉素3天, 定时取样, 外标法定量, 采用高效液相色 谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)检测采样组织中甲砜霉素的残留量.结果显示: 甲砜霉素在 0.1~ 200 ng/mL范围内有良好的线性关系, 相关系数为0.9987.回收率在81.33%~109.72%之间.甲砜霉素 在停止给药后鱼体各检测组织中残留量呈下降趋势, 在停药25天后, 甲砜霉素残留量低于中国与欧盟 规定的最高残留限量(MRLs).根据结果, 建议休药期为25天. 关键词: 甲砜霉素; 高效液相色谱-串联质谱法; 残留; 休药期 中图分类号: S948 文献标志码: A 论文编号: 2013-0115 Study on Thiamphenicol Residue in Common Carp and Crucian Carp Han Bing1,2 , Yang Hongbo1,2 , Wang Di1 , Lu Tongyan1 (1 Heilongjiang River Fisheries Research Institute/Chinese Academy of Fishery Sciences, Harbin 150070; 2 College of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306) Abstract: This experiment was conducted to study the elimination of Thiamphenicol (TAP) residue in common carp (cyprinus carpio) and crucian carp (carassius auratus), preparing for the determination of the withdrawal time. After oral administration of TAP with a dosage of 30 mg/kg body weight per day for 3 days, the fish was sampled at certain time. Quantitative analysis was performed with external standard method and TAP concentrations in tissues were analyzed by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS). The results showed that the linear relationship of TAP was nice (r2 =0.9987) in 0.1 ng/mL to 200 ng/mL concentration range and the recovery ranged from 81.33% to 109.72%. The detection indicated that the residues of TAP in common carp and crucian carp had a down trend. At the 25th day, the residue started to below the maximum residue limits (MRLs) of China and EU. It was proposed that the withdrawal time should be 25 days after administration. Key words: Thiamphenicol; High Performance Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry (HPLC-MS/MS); residue; withdrawal time 中国农学通报 http://www.casb.org.cn 费者健康和中国经济利益具有重要的意义. 随着甲砜霉素残留检测方法的日趋成熟, 甲砜霉 素在水产养殖中残留消除规律和休药期的研究逐渐成 为热点.Malvisi等[3] 对甲砜霉素经多次口服在石斑鱼 体内的组织分布和残留消除进行了研究, 以4g/kg 口灌TAP, 每天一次, 连续 5 天, 在停药后第 3 天, 肌肉和 皮肤中TAP都低于50 μg/kg; 郝凯[4] 研究了甲砜霉素分 别以15 mg/kg和30 mg/kg连续口服5天在鲈鱼肌肉中 的残留消除规律, 根据结果, 笔者推荐低剂量的休药期 为5天, 高剂量的休药期为 6 天; 李静[5] 以15 mg/kg 的 剂量连续对鲫鱼口灌给药3天, 根据结果, 建议在10℃ 和25℃两个季节水温条件下, 休药期分别不应低于为 10天和6天. 目前, 对于甲砜霉素在水产养殖中残留消除规律 和休药期的研究仍旧较少, 并且就已有研究来看, Malvisi的用药量明显不符合实际的水产养殖应用, 郝 凯只研究了鲈鱼肌肉中甲砜霉素的残留消除规律, 忽 略了其他可食用组织, 而李静对于休药期的预测则是 根据残留消除方程计算得出, 缺乏实际的试验数据支 持.因此, 以实际的养殖环境和用药量来研究甲砜霉 素在鱼体内各可食用组织的残留消除规律, 进而确定 休药期显得尤为重要.本研究以鲤鱼与鲫鱼为检测对 象, 采用目前国内外检测甲砜霉素首推的高效液相色 谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS), 测定以 30 mg/kg 的给 药量口灌给药3天后TAP在鲤鱼和鲫鱼组织中残留消 除规律, 旨在为水产养殖中科学合理使用甲砜霉素提 供依据. 1 材料与方法 1.1 仪器与材料 液相色谱-质谱联用仪 (ACQuity, 美国 Waters 公司) ; SiGmA 3K15 离心机; Anke TDL-40B 离心机; T-214 电子天平 (购自北京赛多利斯仪器系统有限公 司) , FJ200-S调速混匀器(上海标准模型厂制造); 真空 旋转蒸发器 (RE-52AA, 购自上海亚荣生化仪器厂) . 甲砜霉素标准品:含 量98.5% ,德国DR. Ehrenstorfer, 批号 01103; 甲砜霉素原粉: 含量 98.9%, 批号P-047-WS11062101, 购自浙江海翔药业股份有限 公司; 乙酸乙酯、 正己烷和甲醇为色谱纯试剂, 由Merck KGaA 公司生产; 25%氨水. 松浦镜鲤体重: (108.35±15.24)g, 由黑龙江省呼兰 冷水性鱼类试验站提供; 鲫鱼体重: (42.63±7.70)g, 由 黑龙江省五站冷水性鱼类试验站提供; 实验在方形自 动循环水鱼缸中进行, 实验期间持续给氧.实验鱼暂 养7天后, 选择体质健康的个体进行试验, 给药前停饲 24 h.实验期间不投喂, 保持水温在(20±0.2)℃. 1.2 试验方法 1.2.1 给药方法与样品采集 按照 30 mg/kg 的给药剂 量, 每天1次, 对鲤鱼和鲫鱼进行甲砜霉素连续口灌给 药3天, 停药后分别于 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 9、 11、 13、 15、 20、 25天进行采样 (鲫鱼采集体皮、 肌肉、 性腺, 鲤鱼采 集体皮、 肌肉、 肝和肾) . 1.2.2 样本前处理 称取1 g左右待测组织样品, 精确至 0.01 g.置于50 mL聚丙烯离心管中, 加入10 mL碱化 乙酸乙酯 (乙酸乙酯/氨水, 97:3, v/v) , 匀质提取 30 s, 以4000 r/min离心5 min, 上清液转移至鸡心瓶中.在 原管中再加入 10 mL 碱化乙酸乙酯 (乙酸乙酯/氨水, 97:3, v/v) , 洗涤匀质刀头10 s, 洗涤液移入第一支离心 管中, 于漩涡振荡器上涡旋提取 1 min, 以4000 r/min 离心 5 min, 上清液合并至鸡心瓶中, 在45℃旋转蒸发 至干. 鸡心瓶残渣用 2 mL 的10%甲醇溶解, 再加 2 mL 正己烷旋涡混合30 s, 置于10 mL聚丙烯离心管中, 以4000 r/min离心5 min, 移取1 mL下层溶液于15 mL聚 丙烯离心管中, 稀释十倍, 过0.22 μm 有机相滤膜, 供 液相色谱-串联质谱测定. 1.2.3 色谱条件色谱柱:Acquity BEH C18 色谱柱,1.7 μm, 50 mm*2.1 mm (内径) ; 柱温: 40℃; 流动相: 甲醇+水(40+60); 流速: 0.30 mL/min; 进样量: 20 μL. 1.2.4 质谱条件 离子源: 电喷雾离子源(ESI); 扫描方 式: 负离子扫描; 检测方式: 多级反应监测(MRM); 电 喷雾电压(IS): -1750 V; 雾化气、 气帘气、 辅助加热气、 碰撞气均为高纯度氮气及其他合适气体, 使用前应调 节个气体流量以使质谱灵敏度达到检测要求; 辅助气 温: 50℃; 定性离子对(m/z)354.0/290,354.0/185.0、 定量 离子对(m/z)354.0/185.0、 采集时间200 ms、 去簇电压-55 V、 碰撞能量-18 V, -27 V. 1.2.5 标准曲线的测定 用流动相将 TAP 标准品配制 0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0、 200.0 ng/mL 的标准液, 过0.22 μm 有机相滤膜进行测 定.以峰面积为纵坐标, TAP 浓度为横坐标绘制标准 曲线, 求回归方程和相关系数. 1.2.6 样品回收率和精密度的测定 取鲤鱼和鲫鱼的血 浆、 肝脏、 肾脏和肌肉的空白组织, 分别加入甲砜霉素 标准液, 制成含药物浓度10.0、 20.0、 50.0、 100.0、 200.0、 500.0 ng/mL 的样品, 混匀静置, 使药物充分渗入组织 中.按照样品处理方法处理后测定, 按公式: 相对回收率= (实测药物浓度/实际的药物浓度) * 100%进行计算. · · 26 韩 冰等: 甲砜霉素在鲤鱼及鲫鱼体内的残留研究 将上述6个浓度梯度的同一样品在1天内分别重 复测定3次, 在一周内重复测定3次, 计算出不同浓度 梯度下样品的相对标准偏差, 计算日内和日间精密度. 2 结果与分析 2.1 色谱条件 在优化的色谱条件下, 测得样品中TAP保留时间 约为2.64 min, 在保留时间内没有干扰峰的出现, 并且 色谱峰的峰形较佳, 均为基线分离峰.以m/z 354作为 母离子, 选取丰度最强的m/z 185和290作为甲砜霉素 的监测离子, TAP色谱图, 见图1. 2.2 标准曲线 以甲砜霉素的色谱峰面积(Y)为纵坐标, 以进样前 图1 样品中甲砜霉素的MRM色谱图 甲砜霉素的质量浓度(X: ng/mL)为横坐标作图 (见图 2) , 得到其标准曲线.甲砜霉素的线性回归方程为 Y=63.127X+175.32, 相关系数 r2 =0.9987, 线性范围为 0.1~200 ng/mL. 2.3 样品回收率及精密度 本实验条件下, 鲫鱼的皮、 性腺和肌肉的相对回 收率分别为81.33% ~109.72% 、 92.07% ~101.75% 、 98.56%~107.29%, 鲤鱼的皮、 肝脏、 肾脏和肌肉的相对 回收率分别为85.42% ~106.03% 、 84.53% ~96.34% 、 96.54%~102.56%、 97.68%~105.49%.鲤鲫鱼各组织中 回收率在81.33%~109.72%之间, 日内精密度为(1.188± 0.354)%, 日间精密度为(3.522±0.479)%, 可满足实验要 求. 2.4 检出限(LOD) 应用本试验建立的检测方法, 样品中甲砜霉素的 最低检测限均为 0.2 ng/mL(S/N=3).结果表明: 该方 法灵敏度高, 可满足实验要求. 2.5 样品中甲砜霉素残留量的测定 结果见表1~2, 其残留消除曲线分别见图3~4. 将样品按实验方法进行测定, 结果由图 3~4 可以 看出, 样品中检测到的甲砜霉素残留量随着停药天数 的增加呈下降趋势.停药前期甲砜霉素在鲤鱼和鲫鱼 体内各检测组织的残留量下降速度较快, 后期消除缓 慢.在鲤鱼体内, 肾组织中甲砜霉素残留量在相同停 药天数内要高于其他采样组织.在鲫鱼体内, 皮中的 甲砜霉素残留量高于相同停药天数的其他组织.在停 相对强度 /% 相对强度 /% 相对强度 /% 时间/min 时间/min 时间/min · · 27 中国农学通报 http://www.casb.org.cn 药后第25天, 鲤鱼和鲫鱼各检测组织中甲砜霉素残留 量低于中国与欧盟规定的MRLs. 3 结论 通过高效液相色谱-串联质谱法检测甲砜霉素在 鲤鱼与鲫鱼体内的残留量简单、 快速、 灵敏可靠, 可满 足检测的要求.按照 30 mg/kg 的剂量对鲤鱼和鲫鱼 多次口灌甲砜霉素, 在停止给药的第 25 天, 其残留浓 度才低于 50 μg/kg.若以皮肤或肾为靶组织, 为了确 保甲砜霉素残留量低于中国和欧盟的规定的 MRLs, 建议休药期为 25 天.之前的文献报道中未见把性腺 作为采样组织, 因此本实验对其进行研究, 发现甲砜霉 素在性腺中的消除速度快于其他组织, 并且在停药天 图2 甲砜霉素标准品标准曲线 采样时间/d 1 2 3 4 5 6 7 9 11 13 15 20 25 浓度/(μg/g) 肌肉 14.97±5.87 13.98±6.04 6.60±3.17 4.27±2.05 2.97±1.73 1.73±0.83 1.56±0.92 1.49±0.71 1.30±0.62 0.93±0.45 0.58±0.47 0.11±0.05 0.00±0.00 皮21.22±2.35 16.87±2.12 8.27±0.99 4.56±1.03 3.39±0.76 2.13±0.52 1.48±0.37 1.41±0.43 1.28±0.32 0.95±0.28 0.62±0.11 0.08±0.03 0.02±0.00 肝16.19±2.37 12.82±2.18 9.45±1.86 6.43±1.21 4.29±1.75 1.95±0.78 1.65±0.66 1.42±0.37 1.18±0.52 0.86±0.27 0.40±0.14 0.03±0.02 0.00±0.00 肾53.22±5.37 20.28±3.18 17.67±3.07 8.54±2.01 7.82±1.06 5.15±0.78 4.27±1.07 3.17±0.62 1.57±0.48 1.43±0.52 0.62±0.31 0.09±0.03 0.00±0.00 采样时间/d 1 2 3 4 5 6 7 9 11 13 15 20 25 浓度/(μg/g) 肌肉 10.92±4.92 2.73±5.68 1.05±2.48 0.93±2.16 0.83±2.03 0.67±1.78 0.44±1.24 0.41±1.05 0.37±0.78 0.32±0.62 0.15±0.55 0.07±0.11 0.00±0.00 性腺 8.55±2.03 2.33±1.02 1.87±0.74 0.91±0.19 0.54±0.22 0.43±0.13 0.27±0.11 0.14±0.07 0.12±0.05 0.09±0.04 0.08±0.04 0.08±0.01 0.00±0.00 皮11.22±2.46 7.55±2.18 3.74±0.87 2.67±1.03 2.10±0.75 1.33±0.52 1.11±0.38 0.69±0.42 0.62±0.26 0.38±0.19 0.25±0.11 0.18±0.02 0.00±0.00 表1 鲤鱼甲砜霉素残留量 表2 鲫鱼甲砜霉素残留量 R2 =0.9987 · · 28 韩 冰等: 甲砜霉素在鲤鱼及鲫鱼体内的残留研究 数相同时, 残留量也低于其他组织.该结果对研究服 用甲砜霉素后鲫鱼性腺的可食性安全以及性腺中的药 物残留对后代的繁殖发育是否有影响提供了很好的参 考.由于条件限制, 本试验只研究了甲砜霉素在鲤鱼 和鲫鱼体内的残留消除规律, 今后需要对甲砜霉素在 不同的水产动物体内残留消除种属差异性方面加深研 究, 以便为完善食品质量安全体系提供基础. 4 讨论 4.1 检测方法的优化筛选 氯霉素类抗生素在水产品、 畜产品中残留的检测 方法主要有酶联免疫法[6] 、 高效液相色谱法[7] 、 气相色 谱法 (电子捕获检测器) [8] 、 气相色谱-质谱联用法 (GC-MS)[9-10] 和液相色谱-质谱联用法(LC-MS)[11-12] .根 据欧盟委员会 2002/657/EC 决议规定, 禁用兽药的确 证检测方法必须能够提供结构方面的信息, 而且要达 到法规规定的4个确证点, 同时考虑到使用GC-MS法 需对甲砜霉素进行衍生化处理.因此, 最后选择高效 液相色谱-串联质谱法来检测甲砜霉素药物残留. 甲砜霉素微溶于水, 易溶于甲醇、 乙腈、 乙酸乙 酯等有机溶剂.其中, 乙酸乙酯提取效率最高、 毒性 小[13] , 容易挥干,适用于动物组织样品的提取.Pfenning等[14] 发现碱化乙酸乙酯对虾等水产品具有更 高的回收率.因此, 选择碱化乙酸乙酯作为提取剂. 但是, 使用这种提取剂会使大量的脂类及类脂类物质 同时被提取出来, 必须进行适当的净化步骤.常用的 净化方式有液液分配、 GPC和固相萃取(SPE)等[15] .考 虑到固相萃取净化的时间较长以及成本较高, 而质谱 的六通切换阀又能实现类似溶剂延迟的功能, 故采用 液液分配的方式, 将提取液浓缩后, 经正己烷分配除 脂, 直接上机测定.与现有的文献方法相比, 此方法简 便快速, 净化效果良好. 4.2 甲砜霉素在鱼组织中残留消除规律 从试验结果来看, 停药前期甲砜霉素在鲤鱼和鲫 鱼体内各检测组织的残留量下降速度较快, 后期消除 缓慢.鲤鱼和鲫鱼各采样组织中甲砜霉素的最高残留 量均出现在停药后的第一天.在休药期间, 鲤鱼体内, 肝脏中甲砜霉素的残留量在停药后第 20 天就降至 50 μg/kg 以下, 而肾组织中甲砜霉素残留量在相同休 药天数内要高于其他采样组织, 这可能与甲砜霉素在 鱼体内的代谢和排泄有关.在鲫鱼中, 相同休药天数 下, 性腺中甲砜霉素残留量最低, 皮中最高, 考虑到皮 下层是一疏松的脂肪组织, 所以推测这可能与甲砜霉 素的亲脂性有关.在停药后第25天时, 所有采样组织 中TAP的残留量都低于50 μg/kg. 4.3 甲砜霉素与休药期的关系 鲤鱼和鲫鱼按30 mg/kg的给药量, 每天1次, 连续 3天口服给药后, 由检测结果可以看出, 鲤鱼和鲫鱼各 采样组织在停药后第 25 天时开始低于 50 μg/kg, 休药 期明显要高于兽药手册记录的 15 天[16] 以及其他人的 图3 鲤鱼中TAP消除曲线 图4 鲫鱼中TAP消除曲线 · · 29 中国农学通报 http://www.casb.org.cn 研究[3-5] , 这可能与实验鱼种、 养殖环境以及给药方式与 剂量的不同有关.根据中国和欧盟规定的动物可食性 组织MRLs(50 μg/kg) 标准,建议鲤鱼和鲫鱼按30 mg/kg, 每天 1 次, 连续 3 天口服甲砜霉素后, 其WDT为25天. 参考文献 [1] EMEA Committee for Veterinary Medicinal Products. 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中国农学通报 2013,29(26):25-30 Chinese Agricultural Science Bulletin 0 引言 甲砜霉素(Thiamphenicol, TAP)为氯霉素类衍生 物, 又名甲砜氯霉素、 硫霉素(Thienamycin), 具有广谱 抗微生物作用, 对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有 较强的抑制作用, 在水产养殖中对疾病的控制和治疗 能够起到显著的效果.然而, 水产品中药物残留严重 的威胁着食用者的健康.中国和欧盟规定了甲砜霉素 的最高残留限量(MRLs)为50 μg/kg[1-2] .因此, 通过对 甲砜霉素在水产品中残留消除规律的研究, 进而制定 该药的休药期, 对于促进科学合理的使用兽药, 维护消 基金项目: 行业专项 "渔药使用风险评估及其控制技术研究与示范" (201203085); 第一作者简介: 韩冰, 男, 1989年出生, 山东德州人, 硕士, 主要从事鱼类疾病研究.通信地址: 150070 黑龙江省哈尔滨市道里区河松街232号, Tel: 0451-84861322, E-mail: h_bing1022@163.com. 通讯作者: 卢彤岩, 女, 1967年出生, 黑龙江人, 研究员, 主要从事水产动物病害的相关研究.通信地址: 150070 黑龙江省哈尔滨市道里区河松街232 号, Tel: 0451-84861322, E-mail: lutongyan@hotmail.com. 收稿日期: 2013-01-10, 修回日期: 2013-04-22. 甲砜霉素在鲤鱼及鲫鱼体内的残留研究 韩冰1,2 , 杨洪波1,2 , 王荻1 , 卢彤岩1 (1 中国水产科学研究院/黑龙江水产研究所, 哈尔滨 150070; 2 上海海洋大学水产与生命学院, 上海 201306) 摘要: 本研究旨在分析甲砜霉素在鲤鱼和鲫鱼体内的残留消除规律并为制定休药期提供依据.按照 30 mg/kg的给药量对鲤鱼和鲫鱼连续口灌给药甲砜霉素3天, 定时取样, 外标法定量, 采用高效液相色 谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)检测采样组织中甲砜霉素的残留量.结果显示: 甲砜霉素在 0.1~ 200 ng/mL范围内有良好的线性关系, 相关系数为0.9987.回收率在81.33%~109.72%之间.甲砜霉素 在停止给药后鱼体各检测组织中残留量呈下降趋势, 在停药25天后, 甲砜霉素残留量低于中国与欧盟 规定的最高残留限量(MRLs).根据结果, 建议休药期为25天. 关键词: 甲砜霉素; 高效液相色谱-串联质谱法; 残留; 休药期 中图分类号: S948 文献标志码: A 论文编号: 2013-0115 Study on Thiamphenicol Residue in Common Carp and Crucian Carp Han Bing1,2 , Yang Hongbo1,2 , Wang Di1 , Lu Tongyan1 (1 Heilongjiang River Fisheries Research Institute/Chinese Academy of Fishery Sciences, Harbin 150070; 2 College of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306) Abstract: This experiment was conducted to study the elimination of Thiamphenicol (TAP) residue in common carp (cyprinus carpio) and crucian carp (carassius auratus), preparing for the determination of the withdrawal time. After oral administration of TAP with a dosage of 30 mg/kg body weight per day for 3 days, the fish was sampled at certain time. Quantitative analysis was performed with external standard method and TAP concentrations in tissues were analyzed by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS). The results showed that the linear relationship of TAP was nice (r2 =0.9987) in 0.1 ng/mL to 200 ng/mL concentration range and the recovery ranged from 81.33% to 109.72%. The detection indicated that the residues of TAP in common carp and crucian carp had a down trend. At the 25th day, the residue started to below the maximum residue limits (MRLs) of China and EU. It was proposed that the withdrawal time should be 25 days after administration. Key words: Thiamphenicol; High Performance Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry (HPLC-MS/MS); residue; withdrawal time 中国农学通报 http://www.casb.org.cn 费者健康和中国经济利益具有重要的意义. 随着甲砜霉素残留检测方法的日趋成熟, 甲砜霉 素在水产养殖中残留消除规律和休药期的研究逐渐成 为热点.Malvisi等[3] 对甲砜霉素经多次口服在石斑鱼 体内的组织分布和残留消除进行了研究, 以4g/kg 口灌TAP, 每天一次, 连续 5 天, 在停药后第 3 天, 肌肉和 皮肤中TAP都低于50 μg/kg; 郝凯[4] 研究了甲砜霉素分 别以15 mg/kg和30 mg/kg连续口服5天在鲈鱼肌肉中 的残留消除规律, 根据结果, 笔者推荐低剂量的休药期 为5天, 高剂量的休药期为 6 天; 李静[5] 以15 mg/kg 的 剂量连续对鲫鱼口灌给药3天, 根据结果, 建议在10℃ 和25℃两个季节水温条件下, 休药期分别不应低于为 10天和6天. 目前, 对于甲砜霉素在水产养殖中残留消除规律 和休药期的研究仍旧较少, 并且就已有研究来看, Malvisi的用药量明显不符合实际的水产养殖应用, 郝 凯只研究了鲈鱼肌肉中甲砜霉素的残留消除规律, 忽 略了其他可食用组织, 而李静对于休药期的预测则是 根据残留消除方程计算得出, 缺乏实际的试验数据支 持.因此, 以实际的养殖环境和用药量来研究甲砜霉 素在鱼体内各可食用组织的残留消除规律, 进而确定 休药期显得尤为重要.本研究以鲤鱼与鲫鱼为检测对 象, 采用目前国内外检测甲砜霉素首推的高效液相色 谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS), 测定以 30 mg/kg 的给 药量口灌给药3天后TAP在鲤鱼和鲫鱼组织中残留消 除规律, 旨在为水产养殖中科学合理使用甲砜霉素提 供依据. 1 材料与方法 1.1 仪器与材料 液相色谱-质谱联用仪 (ACQuity, 美国 Waters 公司) ; SiGmA 3K15 离心机; Anke TDL-40B 离心机; T-214 电子天平 (购自北京赛多利斯仪器系统有限公 司) , FJ200-S调速混匀器(上海标准模型厂制造); 真空 旋转蒸发器 (RE-52AA, 购自上海亚荣生化仪器厂) . 甲砜霉素标准品:含 量98.5% ,德国DR. Ehrenstorfer, 批号 01103; 甲砜霉素原粉: 含量 98.9%, 批号P-047-WS11062101, 购自浙江海翔药业股份有限 公司; 乙酸乙酯、 正己烷和甲醇为色谱纯试剂, 由Merck KGaA 公司生产; 25%氨水. 松浦镜鲤体重: (108.35±15.24)g, 由黑龙江省呼兰 冷水性鱼类试验站提供; 鲫鱼体重: (42.63±7.70)g, 由 黑龙江省五站冷水性鱼类试验站提供; 实验在方形自 动循环水鱼缸中进行, 实验期间持续给氧.实验鱼暂 养7天后, 选择体质健康的个体进行试验, 给药前停饲 24 h.实验期间不投喂, 保持水温在(20±0.2)℃. 1.2 试验方法 1.2.1 给药方法与样品采集 按照 30 mg/kg 的给药剂 量, 每天1次, 对鲤鱼和鲫鱼进行甲砜霉素连续口灌给 药3天, 停药后分别于 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 9、 11、 13、 15、 20、 25天进行采样 (鲫鱼采集体皮、 肌肉、 性腺, 鲤鱼采 集体皮、 肌肉、 肝和肾) . 1.2.2 样本前处理 称取1 g左右待测组织样品, 精确至 0.01 g.置于50 mL聚丙烯离心管中, 加入10 mL碱化 乙酸乙酯 (乙酸乙酯/氨水, 97:3, v/v) , 匀质提取 30 s, 以4000 r/min离心5 min, 上清液转移至鸡心瓶中.在 原管中再加入 10 mL 碱化乙酸乙酯 (乙酸乙酯/氨水, 97:3, v/v) , 洗涤匀质刀头10 s, 洗涤液移入第一支离心 管中, 于漩涡振荡器上涡旋提取 1 min, 以4000 r/min 离心 5 min, 上清液合并至鸡心瓶中, 在45℃旋转蒸发 至干. 鸡心瓶残渣用 2 mL 的10%甲醇溶解, 再加 2 mL 正己烷旋涡混合30 s, 置于10 mL聚丙烯离心管中, 以4000 r/min离心5 min, 移取1 mL下层溶液于15 mL聚 丙烯离心管中, 稀释十倍, 过0.22 μm 有机相滤膜, 供 液相色谱-串联质谱测定. 1.2.3 色谱条件色谱柱:Acquity BEH C18 色谱柱,1.7 μm, 50 mm*2.1 mm (内径) ; 柱温: 40℃; 流动相: 甲醇+水(40+60); 流速: 0.30 mL/min; 进样量: 20 μL. 1.2.4 质谱条件 离子源: 电喷雾离子源(ESI); 扫描方 式: 负离子扫描; 检测方式: 多级反应监测(MRM); 电 喷雾电压(IS): -1750 V; 雾化气、 气帘气、 辅助加热气、 碰撞气均为高纯度氮气及其他合适气体, 使用前应调 节个气体流量以使质谱灵敏度达到检测要求; 辅助气 温: 50℃; 定性离子对(m/z)354.0/290,354.0/185.0、 定量 离子对(m/z)354.0/185.0、 采集时间200 ms、 去簇电压-55 V、 碰撞能量-18 V, -27 V. 1.2.5 标准曲线的测定 用流动相将 TAP 标准品配制 0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0、 200.0 ng/mL 的标准液, 过0.22 μm 有机相滤膜进行测 定.以峰面积为纵坐标, TAP 浓度为横坐标绘制标准 曲线, 求回归方程和相关系数. 1.2.6 样品回收率和精密度的测定 取鲤鱼和鲫鱼的血 浆、 肝脏、 肾脏和肌肉的空白组织, 分别加入甲砜霉素 标准液, 制成含药物浓度10.0、 20.0、 50.0、 100.0、 200.0、 500.0 ng/mL 的样品, 混匀静置, 使药物充分渗入组织 中.按照样品处理方法处理后测定, 按公式: 相对回收率= (实测药物浓度/实际的药物浓度) * 100%进行计算. · · 26 韩 冰等: 甲砜霉素在鲤鱼及鲫鱼体内的残留研究 将上述6个浓度梯度的同一样品在1天内分别重 复测定3次, 在一周内重复测定3次, 计算出不同浓度 梯度下样品的相对标准偏差, 计算日内和日间精密度. 2 结果与分析 2.1 色谱条件 在优化的色谱条件下, 测得样品中TAP保留时间 约为2.64 min, 在保留时间内没有干扰峰的出现, 并且 色谱峰的峰形较佳, 均为基线分离峰.以m/z 354作为 母离子, 选取丰度最强的m/z 185和290作为甲砜霉素 的监测离子, TAP色谱图, 见图1. 2.2 标准曲线 以甲砜霉素的色谱峰面积(Y)为纵坐标, 以进样前 图1 样品中甲砜霉素的MRM色谱图 甲砜霉素的质量浓度(X: ng/mL)为横坐标作图 (见图 2) , 得到其标准曲线.甲砜霉素的线性回归方程为 Y=63.127X+175.32, 相关系数 r2 =0.9987, 线性范围为 0.1~200 ng/mL. 2.3 样品回收率及精密度 本实验条件下, 鲫鱼的皮、 性腺和肌肉的相对回 收率分别为81.33% ~109.72% 、 92.07% ~101.75% 、 98.56%~107.29%, 鲤鱼的皮、 肝脏、 肾脏和肌肉的相对 回收率分别为85.42% ~106.03% 、 84.53% ~96.34% 、 96.54%~102.56%、 97.68%~105.49%.鲤鲫鱼各组织中 回收率在81.33%~109.72%之间, 日内精密度为(1.188± 0.354)%, 日间精密度为(3.522±0.479)%, 可满足实验要 求. 2.4 检出限(LOD) 应用本试验建立的检测方法, 样品中甲砜霉素的 最低检测限均为 0.2 ng/mL(S/N=3).结果表明: 该方 法灵敏度高, 可满足实验要求. 2.5 样品中甲砜霉素残留量的测定 结果见表1~2, 其残留消除曲线分别见图3~4. 将样品按实验方法进行测定, 结果由图 3~4 可以 看出, 样品中检测到的甲砜霉素残留量随着停药天数 的增加呈下降趋势.停药前期甲砜霉素在鲤鱼和鲫鱼 体内各检测组织的残留量下降速度较快, 后期消除缓 慢.在鲤鱼体内, 肾组织中甲砜霉素残留量在相同停 药天数内要高于其他采样组织.在鲫鱼体内, 皮中的 甲砜霉素残留量高于相同停药天数的其他组织.在停 相对强度 /% 相对强度 /% 相对强度 /% 时间/min 时间/min 时间/min · · 27 中国农学通报 http://www.casb.org.cn 药后第25天, 鲤鱼和鲫鱼各检测组织中甲砜霉素残留 量低于中国与欧盟规定的MRLs. 3 结论 通过高效液相色谱-串联质谱法检测甲砜霉素在 鲤鱼与鲫鱼体内的残留量简单、 快速、 灵敏可靠, 可满 足检测的要求.按照 30 mg/kg 的剂量对鲤鱼和鲫鱼 多次口灌甲砜霉素, 在停止给药的第 25 天, 其残留浓 度才低于 50 μg/kg.若以皮肤或肾为靶组织, 为了确 保甲砜霉素残留量低于中国和欧盟的规定的 MRLs, 建议休药期为 25 天.之前的文献报道中未见把性腺 作为采样组织, 因此本实验对其进行研究, 发现甲砜霉 素在性腺中的消除速度快于其他组织, 并且在停药天 图2 甲砜霉素标准品标准曲线 采样时间/d 1 2 3 4 5 6 7 9 11 13 15 20 25 浓度/(μg/g) 肌肉 14.97±5.87 13.98±6.04 6.60±3.17 4.27±2.05 2.97±1.73 1.73±0.83 1.56±0.92 1.49±0.71 1.30±0.62 0.93±0.45 0.58±0.47 0.11±0.05 0.00±0.00 皮21.22±2.35 16.87±2.12 8.27±0.99 4.56±1.03 3.39±0.76 2.13±0.52 1.48±0.37 1.41±0.43 1.28±0.32 0.95±0.28 0.62±0.11 0.08±0.03 0.02±0.00 肝16.19±2.37 12.82±2.18 9.45±1.86 6.43±1.21 4.29±1.75 1.95±0.78 1.65±0.66 1.42±0.37 1.18±0.52 0.86±0.27 0.40±0.14 0.03±0.02 0.00±0.00 肾53.22±5.37 20.28±3.18 17.67±3.07 8.54±2.01 7.82±1.06 5.15±0.78 4.27±1.07 3.17±0.62 1.57±0.48 1.43±0.52 0.62±0.31 0.09±0.03 0.00±0.00 采样时间/d 1 2 3 4 5 6 7 9 11 13 15 20 25 浓度/(μg/g) 肌肉 10.92±4.92 2.73±5.68 1.05±2.48 0.93±2.16 0.83±2.03 0.67±1.78 0.44±1.24 0.41±1.05 0.37±0.78 0.32±0.62 0.15±0.55 0.07±0.11 0.00±0.00 性腺 8.55±2.03 2.33±1.02 1.87±0.74 0.91±0.19 0.54±0.22 0.43±0.13 0.27±0.11 0.14±0.07 0.12±0.05 0.09±0.04 0.08±0.04 0.08±0.01 0.00±0.00 皮11.22±2.46 7.55±2.18 3.74±0.87 2.67±1.03 2.10±0.75 1.33±0.52 1.11±0.38 0.69±0.42 0.62±0.26 0.38±0.19 0.25±0.11 0.18±0.02 0.00±0.00 表1 鲤鱼甲砜霉素残留量 表2 鲫鱼甲砜霉素残留量 R2 =0.9987 · · 28 韩 冰等: 甲砜霉素在鲤鱼及鲫鱼体内的残留研究 数相同时, 残留量也低于其他组织.该结果对研究服 用甲砜霉素后鲫鱼性腺的可食性安全以及性腺中的药 物残留对后代的繁殖发育是否有影响提供了很好的参 考.由于条件限制, 本试验只研究了甲砜霉素在鲤鱼 和鲫鱼体内的残留消除规律, 今后需要对甲砜霉素在 不同的水产动物体内残留消除种属差异性方面加深研 究, 以便为完善食品质量安全体系提供基础. 4 讨论 4.1 检测方法的优化筛选 氯霉素类抗生素在水产品、 畜产品中残留的检测 方法主要有酶联免疫法[6] 、 高效液相色谱法[7] 、 气相色 谱法 (电子捕获检测器) [8] 、 气相色谱-质谱联用法 (GC-MS)[9-10] 和液相色谱-质谱联用法(LC-MS)[11-12] .根 据欧盟委员会 2002/657/EC 决议规定, 禁用兽药的确 证检测方法必须能够提供结构方面的信息, 而且要达 到法规规定的4个确证点, 同时考虑到使用GC-MS法 需对甲砜霉素进行衍生化处理.因此, 最后选择高效 液相色谱-串联质谱法来检测甲砜霉素药物残留. 甲砜霉素微溶于水, 易溶于甲醇、 乙腈、 乙酸乙 酯等有机溶剂.其中, 乙酸乙酯提取效率最高、 毒性 小[13] , 容易挥干,适用于动物组织样品的提取.Pfenning等[14] 发现碱化乙酸乙酯对虾等水产品具有更 高的回收率.因此, 选择碱化乙酸乙酯作为提取剂. 但是, 使用这种提取剂会使大量的脂类及类脂类物质 同时被提取出来, 必须进行适当的净化步骤.常用的 净化方式有液液分配、 GPC和固相萃取(SPE)等[15] .考 虑到固相萃取净化的时间较长以及成本较高, 而质谱 的六通切换阀又能实现类似溶剂延迟的功能, 故采用 液液分配的方式, 将提取液浓缩后, 经正己烷分配除 脂, 直接上机测定.与现有的文献方法相比, 此方法简 便快速, 净化效果良好. 4.2 甲砜霉素在鱼组织中残留消除规律 从试验结果来看, 停药前期甲砜霉素在鲤鱼和鲫 鱼体内各检测组织的残留量下降速度较快, 后期消除 缓慢.鲤鱼和鲫鱼各采样组织中甲砜霉素的最高残留 量均出现在停药后的第一天.在休药期间, 鲤鱼体内, 肝脏中甲砜霉素的残留量在停药后第 20 天就降至 50 μg/kg 以下, 而肾组织中甲砜霉素残留量在相同休 药天数内要高于其他采样组织, 这可能与甲砜霉素在 鱼体内的代谢和排泄有关.在鲫鱼中, 相同休药天数 下, 性腺中甲砜霉素残留量最低, 皮中最高, 考虑到皮 下层是一疏松的脂肪组织, 所以推测这可能与甲砜霉 素的亲脂性有关.在停药后第25天时, 所有采样组织 中TAP的残留量都低于50 μg/kg. 4.3 甲砜霉素与休药期的关系 鲤鱼和鲫鱼按30 mg/kg的给药量, 每天1次, 连续 3天口服给药后, 由检测结果可以看出, 鲤鱼和鲫鱼各 采样组织在停药后第 25 天时开始低于 50 μg/kg, 休药 期明显要高于兽药手册记录的 15 天[16] 以及其他人的 图3 鲤鱼中TAP消除曲线 图4 鲫鱼中TAP消除曲线 · · 29 中国农学通报 http://www.casb.org.cn 研究[3-5] , 这可能与实验鱼种、 养殖环境以及给药方式与 剂量的不同有关.根据中国和欧盟规定的动物可食性 组织MRLs(50 μg/kg) 标准,建议鲤鱼和鲫鱼按30 mg/kg, 每天 1 次, 连续 3 天口服甲砜霉素后, 其WDT为25天. 参考文献 [1] EMEA Committee for Veterinary Medicinal Products. 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