中国医科大学学报 J C h i n M e d U n i v 第34卷 第3期2005年 6 月·l97· 用Fura一2双波长荧光 法测定 小 鼠海 马细胞 内游 离钙 高明奇 , 张天彪 , 滕赞,孙黎光 ( 1 . 中国医科大学基础医学院机能实验中心 , 辽宁 沈阳 1 1 0 0 0 1 ; 2 . 生物化学与分子生物学教研室 ; 3 . 药学系天然药物学教研室) 【 摘要】 目的: 探 讨小鼠海马细胞分离及 细胞 内钙 离子 浓度 ( [ c a ] ; ) 的测定.方法 : 低浓度胰蛋 白酶消化、 分 离海马细胞 , 采用 c a 荧光指示剂 F u r a 一2双波长荧光法测定 [ c a ] .结果: 海马细胞存 活率超过 9 5 %.细胞 外Ca"1 . 0 m m o l / L时, 静 息状态下海马细胞[ c a ] i 为( 2 1 0 ±1 0 . 7 )n m o l / L .3 0 m m o l / L K C 1 可显著增加 [ c a ] i , 并且 K C 1 的这种效应呈一定的剂量依赖关系.结论 : 低 浓度胰蛋 白酶消化分离小鼠海马细胞简单、 可靠; F u r a 一 2建 立 的双 波长 荧光 法灵敏 、 可靠 . 【 关键词】F u r a . 2 ; 细胞 内游 离钙 ; 海马细胞 ; 小鼠 【 中图分类号】Q 5 8 2 【 文献标识码】A 【 文章编号】0 2 5 8 — 4 6 4 6 ( 2 0 0 5 ) 0 3— 0 1 9 7— 0 2 De t e r m i n a t i o n o f i n t r a c e l l u l a r f r e e Ca i n h i p p o e a m p a l n e ur o n s o f mi c e wi t h Fu r a- 2 d o u b l e - wa v e l e n g t h f l u o r e c e n t t e c h n i q u e GAO Mi n g — q i ,ZHANG T i a n b i a o ,T ENG Z a n ,S UN L i — g u a n g ( 1 . C e n t e r o f F u n c t i o n a l E x p e r i me n t , C o l l e g e o f B a s i c Me d i c a l S c i e n c e s , C h i n a Me di c a l Un i v e r s i t y , S h e n y a n g 1 1 0 0 01 , C h i n a : 2 . D e p a r t me n t o f B i o c h e mi s t r y a n d Mo l e c u l a r 1 3 i o l o g y ; 3 、 De p a r t me n t o f N a t u r a l Dr u g s ,C o l l e g e o f C l i n i c a l Me di c i n e a n d P h a r m a c o l o g y ) 【 A b s t r a c t 】 0 b j e c t i v e : T o e x p l o r e d i s s o c i a t i o n m e t h o d f o r t h e h i p p o c a m p a l n e u r o n s o f m i c e a n d m e a s u r e m e n t o f f r e e i n t r a c e l l u l a r c a l c i u m . M e t h o ds :Di g e s t i n g wi t h l o w c o n c e n t r a t i o n o f t r y p s i n a n d g e n t l y t r i t u r a t i n g mo d e we r e u s e d t o d i s s o c i a t e h i p p o c a mp a l n e u r o n s . C o n c e n t r a t i o n o f C a " wa s me a s u r e d wi t h F u r a - 2 d o u b l e wa v e l e n g t h f l u o r e me t r y .Re s u l t s : T h e c e l l u l a r v i a b i l i t y r a t e W a s o v e r 9 5 % , C o n c e n t r a t i o n o f C a " i n t h e r e s t i n g h i p p o c a p a l n e u r o n w a s( 2 1 0±1 0 . 7 ) n mo l / L o n c o n d i t i o n wh e n c o n c e n t r a t i o n o f C a o u t s i d e t h e c e l l s wa s 1 . 0 mmo l /L . P o t a s s i u m c h 1 o r i d e 0 f 3 0 mmo L / L ma r k e d l v i n . c r e a s e d t h e c o n c e n t r a i o n o f Ca " i n t h e h i p p o c a mp a l n e u r o n s , a n d t h e e f f e c t wa s c o n c e n t r a i o n · d e p e n d e n t . Co n c l u s i o n: T h e me t h o d t o d is s o c i a t e h i p p o c a mp a l n e u r o n s b y d i g e s t i n g wi t h l o w c o n c e n t r a t i o n o f t r y p s i n W a s u s e f u l a n d e a s y ,a n d t h e a — d o p t i o n o f F u r a 一2doublewavelengthflu o r e me t r y i n d i s s o c i a t e d mi c e h i p p o c a mp a l n e u r o n s wa s u s e f u l i n mo n i t o r i n g c h a n g e o f i n t r a e e l l u l a r Ca " . 【 Ke y w o r d s 】 F u r a . 2 ; i n t r a c e l l u l a r f r e e c a l c i u m; h ip p o e a m p a l n e u r o n ; m i c e 细胞内游离 钙离子浓度 ( [ C a ] ; ) 极低 , 与细胞外游 离钙离子浓度相 差10~1 0 倍,[Ca"];的微 小变化 影 响活 细胞 内许 多重要的生 理、生化 过程.目前 国 内已有大 鼠及小 鼠脑 细胞 ¨ J 、 皮质 细胞 l 2 分 离测定 [ C a " ] i 的报道 .本文 采用 F u r a - 2双波长荧 光法测定 分离 的小 鼠海 马[ca"]i,报道如下 . 1 材 料与 方法 1 . 1 材料Fura一2/AM, S i g ma产品;胰蛋白酶 , 美国Biotec进口分装 ; T r i t o n X 一100,Sigma产品. 昆明 系小 鼠,3周龄,雌雄不 限,本校 实验动物部提供.【收稿日期】2 0 0 4 — 0 4—1 4 【 基金项 目】国家自然科学基金资助项 目( 3 9 9 7 0 6 5 1 ) F 一2000型荧光分光光度计 , 日本 日立公 司产 品. 1 . 2 方法 1 . 2 . 1 海马细胞悬 液制备 : 参照 D i l d y等 的方法 并稍作 改进 .小 鼠断 头处 死,1min内取新 鲜海 马 立即置于冰冷的人工脑脊液 ( A C S F , m mo l / L : N a C I 1 2 4,KC I 4. 4,Ca C I 2 1 . 3,Mg S O 4 1 . 3,Na H2 PO 4 1 . 0, N a H C O 3 2 6 , G l u c o s e 1 0 , p H 7 . 4 ) 中 冲洗 2— 3次,剥离脑 膜及 血管后剪碎海 马,以0.25%的胰 蛋 白酶 3 7℃消化 1 5 m i n ; 以冰冷 的含 1 0 %小牛血 清DMEM终止消化 , 过200目筛 网后 , 滤液 以1000r/min离 心5min;用火焰 抛光的玻璃滴管 吹打 ,制备 细胞悬 液;再用含4%牛血 清 白蛋 白的台氏液(mmol/L:Na CI 1 4 0,KCI 3,Mg S O 4 1 ,He p e s 1 0,Ca CI 2 1 , Gl u — c o S e 1 0 , p H 7 . 4 ) 将细胞 浓度调至 ( 1 ~ 2 )*1 0 . / m l . 维普资讯 http://www.cqvip.com 中国医科大学学报第34卷 经 台盼蓝 排斥 试验检查 , 细胞成活率达 9 5 % 以上 . 1 . 2 . 2 F u r a 一 2负载 : 海马细胞悬液 3 7 ℃预温 5 m i n , 加入 F u r a - 2 / A M( 终 浓度 5 I x m o l / L) .3 7℃恒温避 光孵育 负载 4 5 m i n .负载后细胞 用台氏液 洗 2次 ( 离心2000r/min,5min).沉淀 加适 量含 4 % B S A 的 台氏液 [ 细胞 密度( 1 ~ 2 )X 1 0 / m 1 ] 测定 . 1 . 2 . 3 荧光测定[ C a 2 ] ; : 扫描测定标准液 、 负载液 以及细胞 内Fura一2的激 发波长 和发 射 波长 , 正 常情 况下激 发波长 3 4 0 r i m和380nm, 发射波 长510nm. 分别 测量 静息 期 和加 入激 动剂 K C 1 、 拮 抗剂 或 药物 后 的荧 光强度 以及最 大 荧光 比( R 一),最小荧光比(R).根据下面公式计算 [ c a " ] i : [ C a . ] _ ( 哪景R: 荧光比值 ( F 3 4 0 n m/ F 3 8 0 n m) ; K d: F u r a . 2与Ca反应的解 离常 数,37的生 理条件下Kd=2 2 4 n mo l ; F D和Fs:零Ca和Ca饱和时 3 8 0 n m激 发光 产 生的荧 光强度2结果2.1Fura负载和荧光强度 及 R值 小 鼠海马细胞 静息时R>1 , 表明Fura在 胞内与Ca结合良好 ; 加入KCI后R升 高,证明胞外ca"进 入胞 内, 形成 F u r a 一2一Ca",340nm处 光谱荧 光强度 增加 , 3 8 0 n m处 光谱荧光强度减 弱;加入rift—tonX—lOO(终浓度 0 . 2 % ) 后 R值 升至最大 , 提示 细 胞膜破碎 , 游离的Fura-2均 与Cah结合(R);加入EGTA(pH> 8 . 5 , 终 浓度 为细胞外 钙浓 度的3~ 5 倍)即3~ 5 m m o ~L后,R值降至 1 以下 , 表明Fura一2一Ca"中 的Ca2全部被EGTA螯合 , F u r a 一 2处 于未 结合状态 ( R ) ( 图1).蠼O5O 时间/s图l双波长测定细胞内钙离子浓度 F i g . 1 D o u b l e w a v e l e n g t h d e t e r m i n a t i o n o f [ C a 2 ] 2 . 2静息状 态下 [ c a ] . 细胞外C为1mmol/L,海马细胞静息[Ca2']i为(210±1 0 . 7 ) n m o l / L( 4 - s , , l=8 ) . 2 . 3 K C 1 对[ c a "] ; 影响的剂量关系 细胞外 C a "为1mmo l / L , 待 测细胞悬液 中加入 激动剂 K C 1 1 0 , 3 0 , 5 0 m m o ~L时,[cah] ; 分别增加 1 4 % . 6 3 % 和94%,差异十分显著(,l= 8 , P < 0 . 0 1 ) ; 细胞外无 钙(细胞 悬于无 钙 台式 液并 加入 1 m m o l / L E G T A ) 时, K C 1 的[ c a "] ; 增加作用消失. 3 讨论、 3 . 1 海 马细胞的分 离及 其功能的好 坏是 影 响测 定 结果 的关键 因素.死亡细胞 [ c a n ] ; 比正常 细胞 高 出十几倍 , 因此 , 海 马细胞分离 的每一步骤必须 在冰 上 进行 , 以保 证细胞存活率.在 胰蛋白酶 消化 及Fura一2/AM孵 育中注意通混合气(95%O2+5 % C O ) 保 证海 马细 胞 的供 氧 .胰 蛋 白酶 消化 及 结合 玻璃滴管轻轻 吹打的方法制备海 马细胞对细胞无 明 显损伤 , 并 且保持细胞 活性 . 、 3 . 2 F u r a - 2与Quin-2相 比,荧光强度 高,对钙 离子 选 择性好 , 具双重发 射 的可 行性.即 随[ca];的.增高,细胞 内的 F u r a - 2与Ca"结合形 成Fura一2一Ca复合 物,激发光谱 由380nm移 至340nm处 , 这种荧 光 比值变化 的浓度 与ca"浓度 呈 比例关 系,成为定 量 测定 C a "浓度的基 础 .不仅 提高了观 察的信号 强度 , 而且在一定范 围 内不受 F u r a 一 2浓度 和细 胞密度的影 响测定 [ c a ] ; . 3 . 3 影响Fura一2负 载及 测定 的 因素 J : ( 1 ) F u r a - 2 负载 的浓度 为2~7~ r n o l / L .过多 的染料 负 载可 导致酸化和细胞 中毒 . ( 2 )溶液的pH值应 严格 控制 在7.0~7.4.( 3 ) 染料 随时 间漏 到细胞外 , 测 定前 冲洗细胞或缩短细胞光 照 时间 .( 4 ) 激发 光 能量过 强 会造成荧 光 探针 化 学键 断裂,损失荧 光.(5)采用去离子水 , 以去 除水 中重金 属离 子对 F u r a - 2荧光 的影响 和防 止水 中Ca'饱和Fura一2.玻 璃 管壁 可 释放 出Ca¨,应使用塑料 试管 . 3 . 4 钾离 子是一种可兴奋细胞 去极化剂 , 当神经细 胞 去极化到一定 程度 , 则 可激活 细胞 膜上 L型 电压 依赖性钙通道 , 导致 [ c a ' ] ; 升高 】 .在分离的神 经 细胞 , 我们成功地 用Fura-2观察 到这种 去极 化诱 发的 [ c a ] ; 升高 , 进一步证 明 了该法灵敏 、 可靠 . ' 【 参考文献】 [ 1 ]李明, 王峻峰 , 韩济生, 等. 应用 F u m - 2 / A M检测分离的神经细 胞内游离钙浓度及其变化[ J ] . 药学学报 , 1 9 9 1 , 2 6 ( 1 2 ) : 8 9 0— 8 9 4. [ 2 ]母敬郁 , 王峤 , 王之 光, 等. 用Fum- 2 / A M 检测皮层 神经细 胞[ca"]j的方 法[J].白求恩 医科 大 学学 报,2 0 0 1 , 2 7( 2 ) : l 1 9—1 2 0 . ( 下转第 2 0 0页) 维普资讯 http://www.cqvip.com · 2 0 o· 中国医科大学学报第34卷 2 结果2.1MK的We s t e r n b l o t 检测结果 3个月糖尿病 组坐骨神 经MK表达较 对照 组增 加(图1).MK— 糠尿 病组 对照组图1MK蛋 白印迹检 测Fi g .1 W e s t e r n a n a l y s i s o f M K 2 . 2 M K的免疫组化染 色结果 3个月糖 尿病 组坐骨神 经雪旺细胞 、 轴突MK表达强 阳性 , 对 照组 M K表达弱 阳性 , 两组 差别 显著 ( P <0 . 0 1 ) ; 6 个 月糖 尿病组 M K表达 弱 阳性 , 雪旺 细胞减 少,对照 组MK表达弱 阳性 , 两组 间差别 不显 著(尸>0 . 0 5 ) , 见表 1 . 表1MK在大鼠坐 骨 神经 的表达 ( ±s , 积分 光密度)Tab.1TheexpressionofMK i n s c i a t i c n e r v e i n r a t( ±s , i n — t e g r a t e d o p t i c a l d e n s i t y ) 注:1)与对照 组 比较 P <0 . 0 1 3 讨论 Mi d k i n e 家族 包括中期 因子 ( MK) 和肝素结合生长相关分子或 多效 营养 因子 , 是 一类 新 的肝素 结 合生 长/ 分化因子.MK和肝 素结 合生长相关分子具有 促进神经生长发育、分化和神经营养保护作用¨,还具有促进神经元轴突生长的作用.MK 刺激血 管 内皮 细胞增生和血 管新生],增加血管 内皮细 胞 的纤 溶活性,是一种新的纤 溶活性调节剂引. 本文观察发现 3 个月的糖尿病大 鼠坐骨神经纤 维 中雪 旺细胞 、 轴突 MK表达强 阳性 , 表 明糖尿病 神 经损伤 时MK起到保护神 经 的作 用.6个月 时 由于 长期 糖尿病造成雪 旺细胞 功 能受损 , M K表达 下降 . 糖 尿病周 围神经病 变 的发病机 制与长期 严重 的高血 糖 及其 导致 的代谢 障碍 、 微 循环异常 等多因素有关 . 其 中神经 的血管病 变和营养 因子缺乏是两个重 要原 因.MK和HB—GAM作用相互协同,使Midkine家 族 的作用得 到充分 发挥 , 涵盖神经修 复的许 多方面 , 且 与糖尿病周 围神 经病 变 的多因素发病 机制 密切相 关,应用 M i d k i n e家族 可能为糖 尿病 周 围神 经 病变 的治疗提供新 的手段 . 【 参考文献 】 Ca r v a lh o BN ,Ra u l a i s D ,R a uv a la H ,e t a 1 .HB— GAM/P l e i o t r o p h i n a n d mi d k i n e a r e d i f fe r e n t l y e x p r e s s e d a n d d i s t r l h ut e d d u r in g r e t i n o i c a c i d — i n d u c e d n e u r a l d i f f e r e n t i a t i o n o f P 1 9 c e l l s [ J ] .G r o w th F a c . t o r s ,2 0 0 3, 2 1 ( 3— 4) :1 3 9—1 4 9 . Hi d a H, J u n g C G,W u C Z,e t a 1. P l e i o t r op h i n e x h i b i t s a t r op h i e e f f e c t o n s u r v i v a l o f d o p a m i n e r g i c n e u r o n s i n v i t r o [ J ] .E u r J N e u . r o s c i , 2 0 0 3, 1 7 ( 1 0 ): 2 1 2 7—2 1 3 4 . Xi a o YY, S e g a l MR ,Ro b e r t D ,e t a 1. As s e s s me n t o f d i f fe r e n t i a l g e n e e x p r e s s i o n i n h u m a n p e r i p h e r a l n e r v e i n j u r y [ J ] .B M C G e — n o mi c s , 2 0 0 2, 3( 1 ): 2 8 . C h o u n d h u f i R , Z h a n g H, D o m i n i S , e t a 1 .A n a n # o g e n i c r o l e f o r t h e n e u r ok i n e s m i d k i n e a n d p l e i o t r o p h i n i n t u m o r g e n e s i s [ J ] .C a ne — e r R e s , 1 9 9 7 ,5 7 ( 9 ): 1 8 1 4—1 8 1 9 . S u mi Y ,M u r a ma t s u H ,Ta k e i Y ,e t a 1 . Mi d k i ne. a h e p a 6n — bi n d i n g g r o wt h f a c t o r , p r o mo t e s g r o wt h a n d g l y c os a mi n o g l y c a n s y n t h e s i s o f e n d o t h e l i a l c e Us t h r o u g h i t s a c t i o n o n s mo o t h mu s c l e c e l l s i n a n a r t i . f i c i a l b l o o d v e s s e l m o d e l [ J ] .J C e l l S c i , 2 0 0 2 ,1 1 5 ( 1 3 ) : 2 6 5 9— 26 6 7. K o j i ma S ,Mu r a ma t s u H,Mu r a ma t s u T,e t a 1.Mi d k i n e e n h a nc e s f i b r i n o l y t i c a c t i v i t y o f b o v i n e e n d o t h e l i a l c e l l [ J ] .J B i o l C h e m, 1 9 9 5, 2 7 0 ( 1 6) : 9 5 9 0—9 5 9 6 . … 一一'.一..一'.……一..一..一''一..-一'….一… … 一…一.……一一…… … … … 一. … 一一一一- ( 上接第 1 9 8页) [ 3 ] [ 4 ] D i l d y J E,L e s l i e S W .E t h a n o l i n h i h i t s NMDA . i n d u c e d i n c r e a s e s i n f r e e i n t r a c e l l u l a r C a i n d i s s o oi a t e d b r a i n c e l l s [ J ] .B r a i n R e s , 1 9 8 9, 4 9 9 ( 2 ): 3 8 3— 3 8 7 . H i r s t R A, H a r r i s o n C , H i r o t a K , e t a 1 . Me a s u r em e n t o f [ C a 2 ] i i n w h o l e c e l l s u s p e n s i o n s u s i n g f u r a - 2 [ J ] .Me t h o ds Mo l B i o l , 1 9 9 9 , 1 1 4( 1 ) : 3 l 一3 9 . [ 5 ]S h i r o t a n i K, K a t s u r a M, H i g o A. e t a 1 . S u p p r e s s i o n o f C a 2 i n f l u x t h r o ug h L— t y pe v o l t a g e · d e p e n d e n t c a l c i u m c h a n n e l s b y h y d r o x y l r a d — i c a l i n m o u s e c e r e b r a l c o r t i c a l n e u r o n s [ J ] . B r a i n R e s M o l B r a i n R e s , 2 0 01 , 9 2 ( 1 - 2 ): 1 2—1 8 . 1 J 1 J 1 J 1 J 1 J 1 J 二J 维普资讯 http://www.cqvip.com
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中国医科大学学报 J C h i n M e d U n i v 第34卷 第3期2005年 6 月·l97· 用Fura一2双波长荧光 法测定 小 鼠海 马细胞 内游 离钙 高明奇 , 张天彪 , 滕赞,孙黎光 ( 1 . 中国医科大学基础医学院机能实验中心 , 辽宁 沈阳 1 1 0 0 0 1 ; 2 . 生物化学与分子生物学教研室 ; 3 . 药学系天然药物学教研室) 【 摘要】 目的: 探 讨小鼠海马细胞分离及 细胞 内钙 离子 浓度 ( [ c a ] ; ) 的测定.方法 : 低浓度胰蛋 白酶消化、 分 离海马细胞 , 采用 c a 荧光指示剂 F u r a 一2双波长荧光法测定 [ c a ] .结果: 海马细胞存 活率超过 9 5 %.细胞 外Ca"1 . 0 m m o l / L时, 静 息状态下海马细胞[ c a ] i 为( 2 1 0 ±1 0 . 7 )n m o l / L .3 0 m m o l / L K C 1 可显著增加 [ c a ] i , 并且 K C 1 的这种效应呈一定的剂量依赖关系.结论 : 低 浓度胰蛋 白酶消化分离小鼠海马细胞简单、 可靠; F u r a 一 2建 立 的双 波长 荧光 法灵敏 、 可靠 . 【 关键词】F u r a . 2 ; 细胞 内游 离钙 ; 海马细胞 ; 小鼠 【 中图分类号】Q 5 8 2 【 文献标识码】A 【 文章编号】0 2 5 8 — 4 6 4 6 ( 2 0 0 5 ) 0 3— 0 1 9 7— 0 2 De t e r m i n a t i o n o f i n t r a c e l l u l a r f r e e Ca i n h i p p o e a m p a l n e ur o n s o f mi c e wi t h Fu r a- 2 d o u b l e - wa v e l e n g t h f l u o r e c e n t t e c h n i q u e GAO Mi n g — q i ,ZHANG T i a n b i a o ,T ENG Z a n ,S UN L i — g u a n g ( 1 . C e n t e r o f F u n c t i o n a l E x p e r i me n t , C o l l e g e o f B a s i c Me d i c a l S c i e n c e s , C h i n a Me di c a l Un i v e r s i t y , S h e n y a n g 1 1 0 0 01 , C h i n a : 2 . D e p a r t me n t o f B i o c h e mi s t r y a n d Mo l e c u l a r 1 3 i o l o g y ; 3 、 De p a r t me n t o f N a t u r a l Dr u g s ,C o l l e g e o f C l i n i c a l Me di c i n e a n d P h a r m a c o l o g y ) 【 A b s t r a c t 】 0 b j e c t i v e : T o e x p l o r e d i s s o c i a t i o n m e t h o d f o r t h e h i p p o c a m p a l n e u r o n s o f m i c e a n d m e a s u r e m e n t o f f r e e i n t r a c e l l u l a r c a l c i u m . M e t h o ds :Di g e s t i n g wi t h l o w c o n c e n t r a t i o n o f t r y p s i n a n d g e n t l y t r i t u r a t i n g mo d e we r e u s e d t o d i s s o c i a t e h i p p o c a mp a l n e u r o n s . C o n c e n t r a t i o n o f C a " wa s me a s u r e d wi t h F u r a - 2 d o u b l e wa v e l e n g t h f l u o r e me t r y .Re s u l t s : T h e c e l l u l a r v i a b i l i t y r a t e W a s o v e r 9 5 % , C o n c e n t r a t i o n o f C a " i n t h e r e s t i n g h i p p o c a p a l n e u r o n w a s( 2 1 0±1 0 . 7 ) n mo l / L o n c o n d i t i o n wh e n c o n c e n t r a t i o n o f C a o u t s i d e t h e c e l l s wa s 1 . 0 mmo l /L . P o t a s s i u m c h 1 o r i d e 0 f 3 0 mmo L / L ma r k e d l v i n . c r e a s e d t h e c o n c e n t r a i o n o f Ca " i n t h e h i p p o c a mp a l n e u r o n s , a n d t h e e f f e c t wa s c o n c e n t r a i o n · d e p e n d e n t . Co n c l u s i o n: T h e me t h o d t o d is s o c i a t e h i p p o c a mp a l n e u r o n s b y d i g e s t i n g wi t h l o w c o n c e n t r a t i o n o f t r y p s i n W a s u s e f u l a n d e a s y ,a n d t h e a — d o p t i o n o f F u r a 一2doublewavelengthflu o r e me t r y i n d i s s o c i a t e d mi c e h i p p o c a mp a l n e u r o n s wa s u s e f u l i n mo n i t o r i n g c h a n g e o f i n t r a e e l l u l a r Ca " . 【 Ke y w o r d s 】 F u r a . 2 ; i n t r a c e l l u l a r f r e e c a l c i u m; h ip p o e a m p a l n e u r o n ; m i c e 细胞内游离 钙离子浓度 ( [ C a ] ; ) 极低 , 与细胞外游 离钙离子浓度相 差10~1 0 倍,[Ca"];的微 小变化 影 响活 细胞 内许 多重要的生 理、生化 过程.目前 国 内已有大 鼠及小 鼠脑 细胞 ¨ J 、 皮质 细胞 l 2 分 离测定 [ C a " ] i 的报道 .本文 采用 F u r a - 2双波长荧 光法测定 分离 的小 鼠海 马[ca"]i,报道如下 . 1 材 料与 方法 1 . 1 材料Fura一2/AM, S i g ma产品;胰蛋白酶 , 美国Biotec进口分装 ; T r i t o n X 一100,Sigma产品. 昆明 系小 鼠,3周龄,雌雄不 限,本校 实验动物部提供.【收稿日期】2 0 0 4 — 0 4—1 4 【 基金项 目】国家自然科学基金资助项 目( 3 9 9 7 0 6 5 1 ) F 一2000型荧光分光光度计 , 日本 日立公 司产 品. 1 . 2 方法 1 . 2 . 1 海马细胞悬 液制备 : 参照 D i l d y等 的方法 并稍作 改进 .小 鼠断 头处 死,1min内取新 鲜海 马 立即置于冰冷的人工脑脊液 ( A C S F , m mo l / L : N a C I 1 2 4,KC I 4. 4,Ca C I 2 1 . 3,Mg S O 4 1 . 3,Na H2 PO 4 1 . 0, N a H C O 3 2 6 , G l u c o s e 1 0 , p H 7 . 4 ) 中 冲洗 2— 3次,剥离脑 膜及 血管后剪碎海 马,以0.25%的胰 蛋 白酶 3 7℃消化 1 5 m i n ; 以冰冷 的含 1 0 %小牛血 清DMEM终止消化 , 过200目筛 网后 , 滤液 以1000r/min离 心5min;用火焰 抛光的玻璃滴管 吹打 ,制备 细胞悬 液;再用含4%牛血 清 白蛋 白的台氏液(mmol/L:Na CI 1 4 0,KCI 3,Mg S O 4 1 ,He p e s 1 0,Ca CI 2 1 , Gl u — c o S e 1 0 , p H 7 . 4 ) 将细胞 浓度调至 ( 1 ~ 2 )*1 0 . / m l . 维普资讯 http://www.cqvip.com 中国医科大学学报第34卷 经 台盼蓝 排斥 试验检查 , 细胞成活率达 9 5 % 以上 . 1 . 2 . 2 F u r a 一 2负载 : 海马细胞悬液 3 7 ℃预温 5 m i n , 加入 F u r a - 2 / A M( 终 浓度 5 I x m o l / L) .3 7℃恒温避 光孵育 负载 4 5 m i n .负载后细胞 用台氏液 洗 2次 ( 离心2000r/min,5min).沉淀 加适 量含 4 % B S A 的 台氏液 [ 细胞 密度( 1 ~ 2 )X 1 0 / m 1 ] 测定 . 1 . 2 . 3 荧光测定[ C a 2 ] ; : 扫描测定标准液 、 负载液 以及细胞 内Fura一2的激 发波长 和发 射 波长 , 正 常情 况下激 发波长 3 4 0 r i m和380nm, 发射波 长510nm. 分别 测量 静息 期 和加 入激 动剂 K C 1 、 拮 抗剂 或 药物 后 的荧 光强度 以及最 大 荧光 比( R 一),最小荧光比(R).根据下面公式计算 [ c a " ] i : [ C a . ] _ ( 哪景R: 荧光比值 ( F 3 4 0 n m/ F 3 8 0 n m) ; K d: F u r a . 2与Ca反应的解 离常 数,37的生 理条件下Kd=2 2 4 n mo l ; F D和Fs:零Ca和Ca饱和时 3 8 0 n m激 发光 产 生的荧 光强度2结果2.1Fura负载和荧光强度 及 R值 小 鼠海马细胞 静息时R>1 , 表明Fura在 胞内与Ca结合良好 ; 加入KCI后R升 高,证明胞外ca"进 入胞 内, 形成 F u r a 一2一Ca",340nm处 光谱荧 光强度 增加 , 3 8 0 n m处 光谱荧光强度减 弱;加入rift—tonX—lOO(终浓度 0 . 2 % ) 后 R值 升至最大 , 提示 细 胞膜破碎 , 游离的Fura-2均 与Cah结合(R);加入EGTA(pH> 8 . 5 , 终 浓度 为细胞外 钙浓 度的3~ 5 倍)即3~ 5 m m o ~L后,R值降至 1 以下 , 表明Fura一2一Ca"中 的Ca2全部被EGTA螯合 , F u r a 一 2处 于未 结合状态 ( R ) ( 图1).蠼O5O 时间/s图l双波长测定细胞内钙离子浓度 F i g . 1 D o u b l e w a v e l e n g t h d e t e r m i n a t i o n o f [ C a 2 ] 2 . 2静息状 态下 [ c a ] . 细胞外C为1mmol/L,海马细胞静息[Ca2']i为(210±1 0 . 7 ) n m o l / L( 4 - s , , l=8 ) . 2 . 3 K C 1 对[ c a "] ; 影响的剂量关系 细胞外 C a "为1mmo l / L , 待 测细胞悬液 中加入 激动剂 K C 1 1 0 , 3 0 , 5 0 m m o ~L时,[cah] ; 分别增加 1 4 % . 6 3 % 和94%,差异十分显著(,l= 8 , P < 0 . 0 1 ) ; 细胞外无 钙(细胞 悬于无 钙 台式 液并 加入 1 m m o l / L E G T A ) 时, K C 1 的[ c a "] ; 增加作用消失. 3 讨论、 3 . 1 海 马细胞的分 离及 其功能的好 坏是 影 响测 定 结果 的关键 因素.死亡细胞 [ c a n ] ; 比正常 细胞 高 出十几倍 , 因此 , 海 马细胞分离 的每一步骤必须 在冰 上 进行 , 以保 证细胞存活率.在 胰蛋白酶 消化 及Fura一2/AM孵 育中注意通混合气(95%O2+5 % C O ) 保 证海 马细 胞 的供 氧 .胰 蛋 白酶 消化 及 结合 玻璃滴管轻轻 吹打的方法制备海 马细胞对细胞无 明 显损伤 , 并 且保持细胞 活性 . 、 3 . 2 F u r a - 2与Quin-2相 比,荧光强度 高,对钙 离子 选 择性好 , 具双重发 射 的可 行性.即 随[ca];的.增高,细胞 内的 F u r a - 2与Ca"结合形 成Fura一2一Ca复合 物,激发光谱 由380nm移 至340nm处 , 这种荧 光 比值变化 的浓度 与ca"浓度 呈 比例关 系,成为定 量 测定 C a "浓度的基 础 .不仅 提高了观 察的信号 强度 , 而且在一定范 围 内不受 F u r a 一 2浓度 和细 胞密度的影 响测定 [ c a ] ; . 3 . 3 影响Fura一2负 载及 测定 的 因素 J : ( 1 ) F u r a - 2 负载 的浓度 为2~7~ r n o l / L .过多 的染料 负 载可 导致酸化和细胞 中毒 . ( 2 )溶液的pH值应 严格 控制 在7.0~7.4.( 3 ) 染料 随时 间漏 到细胞外 , 测 定前 冲洗细胞或缩短细胞光 照 时间 .( 4 ) 激发 光 能量过 强 会造成荧 光 探针 化 学键 断裂,损失荧 光.(5)采用去离子水 , 以去 除水 中重金 属离 子对 F u r a - 2荧光 的影响 和防 止水 中Ca'饱和Fura一2.玻 璃 管壁 可 释放 出Ca¨,应使用塑料 试管 . 3 . 4 钾离 子是一种可兴奋细胞 去极化剂 , 当神经细 胞 去极化到一定 程度 , 则 可激活 细胞 膜上 L型 电压 依赖性钙通道 , 导致 [ c a ' ] ; 升高 】 .在分离的神 经 细胞 , 我们成功地 用Fura-2观察 到这种 去极 化诱 发的 [ c a ] ; 升高 , 进一步证 明 了该法灵敏 、 可靠 . ' 【 参考文献】 [ 1 ]李明, 王峻峰 , 韩济生, 等. 应用 F u m - 2 / A M检测分离的神经细 胞内游离钙浓度及其变化[ J ] . 药学学报 , 1 9 9 1 , 2 6 ( 1 2 ) : 8 9 0— 8 9 4. [ 2 ]母敬郁 , 王峤 , 王之 光, 等. 用Fum- 2 / A M 检测皮层 神经细 胞[ca"]j的方 法[J].白求恩 医科 大 学学 报,2 0 0 1 , 2 7( 2 ) : l 1 9—1 2 0 . ( 下转第 2 0 0页) 维普资讯 http://www.cqvip.com · 2 0 o· 中国医科大学学报第34卷 2 结果2.1MK的We s t e r n b l o t 检测结果 3个月糖尿病 组坐骨神 经MK表达较 对照 组增 加(图1).MK— 糠尿 病组 对照组图1MK蛋 白印迹检 测Fi g .1 W e s t e r n a n a l y s i s o f M K 2 . 2 M K的免疫组化染 色结果 3个月糖 尿病 组坐骨神 经雪旺细胞 、 轴突MK表达强 阳性 , 对 照组 M K表达弱 阳性 , 两组 差别 显著 ( P <0 . 0 1 ) ; 6 个 月糖 尿病组 M K表达 弱 阳性 , 雪旺 细胞减 少,对照 组MK表达弱 阳性 , 两组 间差别 不显 著(尸>0 . 0 5 ) , 见表 1 . 表1MK在大鼠坐 骨 神经 的表达 ( ±s , 积分 光密度)Tab.1TheexpressionofMK i n s c i a t i c n e r v e i n r a t( ±s , i n — t e g r a t e d o p t i c a l d e n s i t y ) 注:1)与对照 组 比较 P <0 . 0 1 3 讨论 Mi d k i n e 家族 包括中期 因子 ( MK) 和肝素结合生长相关分子或 多效 营养 因子 , 是 一类 新 的肝素 结 合生 长/ 分化因子.MK和肝 素结 合生长相关分子具有 促进神经生长发育、分化和神经营养保护作用¨,还具有促进神经元轴突生长的作用.MK 刺激血 管 内皮 细胞增生和血 管新生],增加血管 内皮细 胞 的纤 溶活性,是一种新的纤 溶活性调节剂引. 本文观察发现 3 个月的糖尿病大 鼠坐骨神经纤 维 中雪 旺细胞 、 轴突 MK表达强 阳性 , 表 明糖尿病 神 经损伤 时MK起到保护神 经 的作 用.6个月 时 由于 长期 糖尿病造成雪 旺细胞 功 能受损 , M K表达 下降 . 糖 尿病周 围神经病 变 的发病机 制与长期 严重 的高血 糖 及其 导致 的代谢 障碍 、 微 循环异常 等多因素有关 . 其 中神经 的血管病 变和营养 因子缺乏是两个重 要原 因.MK和HB—GAM作用相互协同,使Midkine家 族 的作用得 到充分 发挥 , 涵盖神经修 复的许 多方面 , 且 与糖尿病周 围神 经病 变 的多因素发病 机制 密切相 关,应用 M i d k i n e家族 可能为糖 尿病 周 围神 经 病变 的治疗提供新 的手段 . 【 参考文献 】 Ca r v a lh o BN ,Ra u l a i s D ,R a uv a la H ,e t a 1 .HB— GAM/P l e i o t r o p h i n a n d mi d k i n e a r e d i f fe r e n t l y e x p r e s s e d a n d d i s t r l h ut e d d u r in g r e t i n o i c a c i d — i n d u c e d n e u r a l d i f f e r e n t i a t i o n o f P 1 9 c e l l s [ J ] .G r o w th F a c . t o r s ,2 0 0 3, 2 1 ( 3— 4) :1 3 9—1 4 9 . Hi d a H, J u n g C G,W u C Z,e t a 1. P l e i o t r op h i n e x h i b i t s a t r op h i e e f f e c t o n s u r v i v a l o f d o p a m i n e r g i c n e u r o n s i n v i t r o [ J ] .E u r J N e u . r o s c i , 2 0 0 3, 1 7 ( 1 0 ): 2 1 2 7—2 1 3 4 . Xi a o YY, S e g a l MR ,Ro b e r t D ,e t a 1. As s e s s me n t o f d i f fe r e n t i a l g e n e e x p r e s s i o n i n h u m a n p e r i p h e r a l n e r v e i n j u r y [ J ] .B M C G e — n o mi c s , 2 0 0 2, 3( 1 ): 2 8 . C h o u n d h u f i R , Z h a n g H, D o m i n i S , e t a 1 .A n a n # o g e n i c r o l e f o r t h e n e u r ok i n e s m i d k i n e a n d p l e i o t r o p h i n i n t u m o r g e n e s i s [ J ] .C a ne — e r R e s , 1 9 9 7 ,5 7 ( 9 ): 1 8 1 4—1 8 1 9 . S u mi Y ,M u r a ma t s u H ,Ta k e i Y ,e t a 1 . Mi d k i ne. a h e p a 6n — bi n d i n g g r o wt h f a c t o r , p r o mo t e s g r o wt h a n d g l y c os a mi n o g l y c a n s y n t h e s i s o f e n d o t h e l i a l c e Us t h r o u g h i t s a c t i o n o n s mo o t h mu s c l e c e l l s i n a n a r t i . f i c i a l b l o o d v e s s e l m o d e l [ J ] .J C e l l S c i , 2 0 0 2 ,1 1 5 ( 1 3 ) : 2 6 5 9— 26 6 7. K o j i ma S ,Mu r a ma t s u H,Mu r a ma t s u T,e t a 1.Mi d k i n e e n h a nc e s f i b r i n o l y t i c a c t i v i t y o f b o v i n e e n d o t h e l i a l c e l l [ J ] .J B i o l C h e m, 1 9 9 5, 2 7 0 ( 1 6) : 9 5 9 0—9 5 9 6 . … 一一'.一..一'.……一..一..一''一..-一'….一… … 一…一.……一一…… … … … 一. … 一一一一- ( 上接第 1 9 8页) [ 3 ] [ 4 ] D i l d y J E,L e s l i e S W .E t h a n o l i n h i h i t s NMDA . i n d u c e d i n c r e a s e s i n f r e e i n t r a c e l l u l a r C a i n d i s s o oi a t e d b r a i n c e l l s [ J ] .B r a i n R e s , 1 9 8 9, 4 9 9 ( 2 ): 3 8 3— 3 8 7 . H i r s t R A, H a r r i s o n C , H i r o t a K , e t a 1 . Me a s u r em e n t o f [ C a 2 ] i i n w h o l e c e l l s u s p e n s i o n s u s i n g f u r a - 2 [ J ] .Me t h o ds Mo l B i o l , 1 9 9 9 , 1 1 4( 1 ) : 3 l 一3 9 . [ 5 ]S h i r o t a n i K, K a t s u r a M, H i g o A. e t a 1 . S u p p r e s s i o n o f C a 2 i n f l u x t h r o ug h L— t y pe v o l t a g e · d e p e n d e n t c a l c i u m c h a n n e l s b y h y d r o x y l r a d — i c a l i n m o u s e c e r e b r a l c o r t i c a l n e u r o n s [ J ] . B r a i n R e s M o l B r a i n R e s , 2 0 01 , 9 2 ( 1 - 2 ): 1 2—1 8 . 1 J 1 J 1 J 1 J 1 J 1 J 二J 维普资讯 http://www.cqvip.com