长链非编码RNA SPRY4-IT1在食管鳞癌中的表达及 对细胞生长的影响* 谢海伟 陈仿军 朱斌曹刚金磊周国志 吕进曹秀峰 摘要 目的: 探讨长链非编码RNA SPRY4-IT1与食管鳞状细胞癌 (ESCC) 的临床病理及预后的相关性, 以及对细胞生长的 影响.方法: 收集2008年1月至2009 年12月南京医科大学附属南京医院肿瘤外科50 例ESCC手术切除标本 (包括癌组织和癌旁 组织) , 荧光实时定量 PCR (qRT-PCR) 检测 50 例ESCC 中SPRY4-IT1 的表达情况, 分析其与临床病理及预后的关系, 用小干扰 RNA (siRNA) 干扰SPRY4-IT1后MTT法检测其对细胞生长的影响, 流式细胞检测对细胞凋亡和周期的影响.结果: 45例(90%) 标本中SPRY4-IT1呈阳性表达, SPRY4-IT1在癌组织中的表达量显著高于癌旁组织 (t=5.377, P<0.01) .SPRY4-IT1的相对表达 水平与肿瘤大小、 临床分期相关 (P均<0.05) .SPRY4-IT1在ESCC细胞株中表达量高于正常食管上皮细胞.KYSE30细胞中干扰 SPRY4-IT1的表达后可明显减慢细胞生长, 阻滞细胞周期并促进细胞凋亡 (P<0.01) .结论: SPRY4-IT1在ESCC组织中显著高表 达, 并且能促进ESCC细胞生长, 可能成为ESCC诊断和判断预后的重要分子标记物. 关键词 食管鳞癌 长链非编码RNA SPRY4-IT1 增殖 凋亡 doi:10.3969/j.issn.1000-8179.20130707 · 基础研究 · Long non-coding RNA SPRY4-IT1 expression in esophageal squamous cell carcinoma and its effects on cell growth Haiwei XIE, Fangjun CHEN, Bin ZHU, Gang CAO, Lei JIN, Guozhi ZHOU, Jin LV, Xiufeng CAO Correspondence to: Xiufeng CAO; E-mail: cxf551101@sina.com Department of Surgical Oncology, Nanjing Hospital Affiliated to Nanjing Medical University, Nanjing 210006, China. This work was supported by the Young Scientist Funds of the National Natural Science Foundation of China (No. 81201881) and by the Nanjing City Committee of Science and Technology (No. 201108027). Abstract Objective: This study aimed to clarify the correlation of SPRY4-IT1 expression with the clinicopathological character- istics and prognosis of patients with esophageal squamous cell carcinoma (ESCC), as well as the role of SPRY4-IT1 in promoting ES- CC cell growth. Methods: Quantitative real-time polymerase chain reaction for SPRY4-IT1 expression was performed on 50 paired can- cerous and adjacent non-cancerous esophageal specimens. Small interfering RNA was used to suppress SPRY4-IT1 expression to fur- ther explore its role in tumor progression. Cell viability was tested in vitro by MTT assay (OD=490 nm), and cell apoptosis and cell cy- cle were investigated by flow cytometry. Results: We found markedly elevated SPRY4-IT1 expression in cancerous tissues compared with adjacent non-cancerous tissues (90%, P<0.01). Relative SPRY4-IT1 expression levels were correlated with some clinicopathologi- cal characteristics, such as tumor size (χ2 =5.333, P=0.021), elevated TNM (2009) stage classi?cation (χ2 =5.556, P=0.018), and de- creased overall survival rates (χ2 =5.296, P=0.021). SPRY4-IT1 expression level was not correlated with patient age, gender, smoking status, or alcohol consumption (all P>0.05). Further experiments showed that SPRY4-IT1 expression levels were significantly higher in three ESCC cell lines than in the normal human esophageal epithelial cell line Het-1A. In vitro assays of the ESCC cell line KYSE30 demonstrated that knockdown of SPRY4-IT1 expression by small interfering RNA reduced cell growth, mediated cell cycle arrest at the G0-G1 phase, and promoted cell apoptosis (all P<0.01). Conclusion: SPRY4-IT1 was overexpressed in ESCC tissues and ESCC cell lines and promoted the growth of ESCC cells. The dysregulated expression of long non-coding RNA SPRY4-IT1 may play an important role in the process of ESCC development and may be developed as a useful biomarker for the diagnosis and prognosis of ESCC. Keywords: esophageal squamous cell carcinoma, long non-coding RNA, SPRY4-IT1, proliferation, apoptosis 作者单位: 南京医科大学附属南京医院肿瘤外科(南京市210006) ? 本文课题受国家自然科学基金青年项目 (编号: 81201881) 和南京市科委科技发展项目 (编号: 201108027) 资助 通信作者: 曹秀峰 cxf551101@sina.com 非编码 RNAs (ncRNAs) 是不具有编码功能的 RNA 总称,根据其功能的不同,可分为看家型ncRNAs和调节型ncRNAs[1] .根据分子大小 (200 nt) 可分为短链ncRNA—主要为微小RNA (microRNA) 和1011 长链ncRNA[2] .LncRNA是近年来被广泛关注的新型 调节型 ncRNA.LncRNAs 已知在基因转录翻译、 细 胞分化、 表观遗传等生命活动中均发挥了重要的调 控作用[3-5] .目前越来越多的研究证实LncRNAs异常 表达与肿瘤的发生发展有关, 如高表达的 BANCR、 LSINCT5、 HULC 分别与黑色素瘤、 乳腺癌与卵巢癌、 肝癌的发生发展相关[6-8] .而LncRNA 调控食管癌进 展的功能及机制研究鲜见报道.有报道 LncRNA SPRY4-IT1 (Gene ID: AK024556) 在黑色素瘤中高表 达, 并且调控黑色素瘤细胞的生长和转移, 因此认定 为促癌因子[9] .本实验将探讨 SPRY4-IT1 在食管鳞 癌(ESCC) 组织中的表达与临床病理资料的关系, 并 进一步研究其在调控ESCC细胞生长中的功能. 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 病例资料 收集 2008 年1月至 2009 年12 月 南京医科大学附属南京医院肿瘤外科 50 例ESCC 手 术切除标本 (包括癌组织和癌旁组织) , 肿瘤长度 1.1~8.4 cm, 平均长度3.07 cm. 患者年龄33~84岁, 平均年龄59.04岁 (表1 ) . 所有患者均未行术前放化 疗, 均行根治性手术, 留取肿瘤组织及距肿瘤边缘>5 cm 的正常组织, 手术切除标本立即放入液氮保存, 而后 转入-80℃冰箱冻存.50 例标本均经病理诊断为食 管鳞状细胞癌, 按照第 7 版(2009 年) 食管癌 TNM 分 期标准进行临床分期.随访自术后截至 2012 年12 月31 日, 中位随访 37 (8~60) 个月, 2 例失访.本研 究获得南京医科大学附属南京医院伦理委员会批准 并签署知情同意书.人正常食管上皮细胞株Het-1A 购自美国标准菌种库 (Manassas, VA, USA) , KYSE510、 KYSE70s、 KYSE30 细胞系取自食管鳞癌 患者[10-11] , 由中国医学科学院肿瘤研究所刘芝华教 授保存[12] . 1.1.2 试剂与仪器 RPMI-1640 培养液、 胎牛血清 及optimum购自美国Gibco公司.SPRY4-IT1干扰序 列、阴性对照(NC)、 转染试剂lipofectamine 2000、 SPRY4-IT1引物、 GAPDH引物及Trizol由美国Invitro? gen 公司提供.RNA 逆转录试剂盒(DDR047A)、 qRT-PCR 试剂盒由大连TaKaRa 公司提供.ABI 7500 实时荧光定量PCR仪购自美国AB公司. 1.2 方法 1.2.1 RNA提取及实时荧光定量PCR (qRT-PCR) 用Trizol 法取50~100 mg 正确保存的冻存组织, 磨成 粉末状, 加1 mL Trizol, 再次研磨混匀后抽提RNA.细 胞中抽提 RNA 时, 每(1~5) *107 个细胞中加入 1 mL Trizol, 静置 5 min, 用1mL 枪头吹打均匀.抽提后的 RNA 使用分光光度计测定波长 260、 280 nm 的吸收 值, 计算 RNA 浓度并评估纯度, RNA 样品 A260/A280 在1.8~2.1 为合格.RNA 逆转录按照 TaKaRa 公司的 Prime-ScriptTM 逆转录试剂盒说明书指示两步法逆转 录成 cDNA.实时荧光定量 PCR 按照 SYBR Green 说 明书配制反应体系, 每个样本设 3 个副孔重复. SPRY4-IT1 上游引物为 5'-AGCCACATAAATTCAGC AGA-3', 下游引物为5'-CGATGTAGTAGGATTCC TTTCA-3'. 使用GAPDH 作为内参,上游引物为5'-GTCAACGGATTTGGTCTGTATT-3', 下游引物为5'-AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3'. 使用 2^-ΛΛct 法 计算 SPRY4-IT1 在癌组织相对于癌旁组织的表达 量, 相对表达量小于1认为是阴性, 反之认为是阳性. 1.2.2 细胞培养及转染 所有细胞均使用RPMI-1640 培养液 (含10%胎牛血清) , 5%CO2、 37℃、 相对湿度 90%条件下培养, KYSE30 细胞培养至对数生长期用 于细胞转染.3条SPRY4-IT1的干扰序列分别为: 467: 5'-CCCAGAATGTTGACAGCTGCCTCTT-3';491:5'-T GGAGGGTTATGGGAGCCTGTGAAT-3';594:5'-GCT TTCTGATTCCAAGGCCTATTAA-3'.以乱序的 nega? tive control (NC) 作为对照.转染前1天以5*105 个/孔 的密度接种 6 孔板.待细胞生长到 80%~90%融 合时转染.转染前 240 μL optimum 中加入 10 μL lipofectamine 2000, 混匀后静置 5 min, 随后按照说明 书取 SPRY4-IT1 干扰序列 50 nmoL 溶于 optimum 至250 μL, 室温静置20 min; 将6孔板中细胞清洗2次, 每孔 加入上述溶液500 μL.转染后6 h换成含10%胎牛血 清的RPMI-1640培养液继续培养48 h用于进一步实验. 表1 50例ESCC患者一般资料 Table 1 General information of 50 ESCC patients Category Gender Male Female Section Neck Upper thoracic Middle thoracic Lower thoracic TNM Ⅰ-Ⅱ Ⅲ-Ⅳ Differentiation High Middle Low Cases 34 16 2 10 24 14 32 18 16 22 12 Rate (%) 68.00 32.00 4.00 20.00 48.00 28.00 64.00 36.00 32.00 44.00 24.00 1012 1.2.3 MTT 法绘制细胞生长曲线 将转染 NC 和SPRY4-IT1 干扰序列后 48 h 的KYSE30 细胞分别以 5*103 /孔接种于 96 孔板, 于接种后 6、 24、 48、 72、 96 h 每组取 6 孔, 加入 MTT (四甲基偶氮唑蓝) 20 μL, 4 h 后去除培养基, 加入 150 μL DMSO (二甲基亚砜) , 平 板震荡器上震荡15 min.在96孔全波段酶标仪上测 定波长为490 nm的吸光度 (A) , 取6孔平均值为结果 (A 值) , 以时间为横轴, A 值为纵轴绘制细胞生长曲 线, si-RNA对KYSE30细胞的抑制率 (%) = (1-实验组 A值/对照组A值) *100%. 1.2.4 流式细胞仪检测细胞周期和凋亡 细胞转染 后48 h, 消化收获培养细胞, 1 000 r/m 离心 5 min, 弃 上清, 将细胞用冷的 PBS 洗涤 2 次, 重悬于 75%乙醇 并于-20℃固定过夜, 洗涤离心后加入含有10 μg/mL 溴化丙啶 (PI) 和0.1%RNase A的PBS液500 μL, 室温 避光染色30 min后上流式细胞仪测定细胞周期.检 测细胞凋亡时消化收集细胞, 洗涤后重悬于 200 μL 的结合缓冲液, 加入10 μL Annexin V-FTC和5 μL的PI轻轻混匀, 避光室温反应15 min, 再加入300 μL结 合缓冲液, 流式细胞仪测定细胞凋亡情况, 以百分数 表示凋亡率. 1.3 统计学分析 应用SPSS 18.0统计软件对实验数据进行统计分 析.定量资料采用独立样本 t 检验, 分类资料采用χ2 检验或 Fisher 精确概率法.将失访及至观察结束仍 存活的病例设为截尾数据, Kaplan-Meier和Log-rank 检验分析生存率差别.双侧检验P<0.05为差异有统 计学意义. 2 结果 2.1 SPRY4-IT1 在ESCC 中的表达及与临床病理特 征的关系 50 例样本中45 例SPRY4-IT1 呈阳性表达(90%) , 5 例呈阴性表达 (10%) .SPRY4-IT1 在癌 组织中的相对表达量见图 1, 显著高于癌旁组织 (t=5.377, P<0.01) .以SPRY4-IT1 相对表达量的中 位值 (6.16) 为界, 将50 例样本分为高低表达两组, SPRY4-IT1的表达水平和肿瘤大小、 临床病理分期密 切相关, 但与分化水平、 淋巴结转移、 年龄、 性别、 吸烟、 饮酒未见明显相关 (表2) .截至随访结束, 两组生 存率差异有统计学意义 (图2, Log-rank检验χ2 =5.296, P=0.021) . 2.2 SPRY4-IT1在ESCC细胞株中的表达 用qRT-PCR 检测SPRY4-IT1 在ESCC 细胞株KYSE510、 KYSE70s、 KYSE30及正常食管上皮细胞株 HET-1A 中的表达水平, 发现 SPRY4-IT1 在ESCC 细胞株中表达量均高于HET-1A(图3). 其中在KYSE30细胞株中表达量最高, 用SPRY4-IT1的干扰 序列转染 KYSE30 细胞, 检测序列 594 的干扰效率最 高,对SPRY4-IT1 抑制率达 (70.45±4.12) %, 其余两 条无明显干扰效率, 与文献报道一致[9] . 图1 SPRY4-IT1在癌组织中相对于癌旁组织的表达量 Figure 1 SPRY4-IT1 expression level in tumor tissues relative to adja? cent non-cancerous tissues 表2 SPRY4-IT1表达水平与临床病理因素之间的关系 例(%) Table 2 Association of SPRY4-IT1 expression level with clinicopatho? logic factors n (%) 80 70 60 50 40 30 20 10 0 SPRY4-IT1 relative expression 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49 No. of the samples Pathological factors Age(years) ≤59 >59 Gender Male Female Smoking status + - Alcohol consumption + _ Differention Low Middle High Tumor size(cm) <3 ≥3 Lymph node metastasis + - TNM stage Ⅰ, Ⅱ Ⅲ, Ⅳ High SPRY4-IT1 level(n=25) 9 (36.00) 16 (64.00) 16 (64.00) 9 (36.00) 12 (48.00) 13 (52.00) 11 (44.00) 14 (56.00) 7 (28.00) 11 (44.00) 7 (28.00) 6 (24.00) 19 (76.00) 14 (56.00) 11 (44.00) 12 (48.00) 13 (52.00) Low SPRY4-IT1 level(n=25) 13 (52.00) 12 (48.00) 18 (72.00) 7 (28.00) 11 (44.00) 14 (56.00) 9 (36.00) 16 (64.00) 5 (20.00) 11 (44.00) 9 (36.00) 14 (56.00) 11 (44.00) 8 (32.00) 17 (68.00) 20 (80.00) 5 (20.00) χ2 1.299 0.368 0.081 0.333 0.629 5.333 2.922 5.556 P 0.254 0.544 0.777 0.564 0.721 0.021 0.087 0.018 1013 2.3 MTT 检测干扰 SPRY4-IT1 对KYSE30 细胞增殖 能力的影响 SPRY4-IT1 的表达量和肿瘤大小相关, 表明 SPRY4-IT1有可能参与细胞生长的调节, 因此本研究 用MTT 检测转染 SPRY4-IT1 干扰序列对 KYSE30 细 胞生存活力的影响, 发现干扰 SPRY4-IT1 的表达后 KYSE30 细胞生长明显慢于对照组细胞 (图4) , 24 h 开始干扰SPRY4-IT1组细胞生长慢于对照组, 48 h抑 制率为36.66%, 96 h抑制率为48.89%. 2.4 干扰SPRY4-IT1对KYSE30细胞周期的影响 流式细胞仪检测细胞周期显示, si-SPRY4-IT1/ KYSE30 组与 si-NC/KYSE30 细胞比较, G0/G1 期细胞 由(52.36±4.98) %增加到 (62.18±5.34) % (P<0.01) , S 期细胞由 ( 30.16±2.76 ) %降为 ( 27.91±1.99 ) % ( P<0.01 ) , G2/M 期细胞由(17.03±1.87) % 降为(9.91±2.55) % ( P<0.01 ) , 提示细胞周期阻滞于G0/G1期 (图5) . 2.5 干扰SPRY4-IT1对KYSE30细胞凋亡的影响 流式细胞检测细胞凋亡分析, 获得由四个象限 组成的散点图 (图6) , 右上象限属于晚期凋亡细胞, 右下象限属于早期凋亡细胞, 右上象限和右下象限 的细胞百分比总和为凋亡率, 转染 si-SPRY4-IT1 组 凋亡细胞为 (36.10±1.99) %, 对照组为 (25.97±1.68) % (P<0.01) . 图2 SPRY4-IT1高表达组与低表达组生存率曲线 Figure 2 Cumulative survival rates of patients with high and low SPRY4-IT1 expression levels 图3 SPRY4-IT1在食管鳞癌细胞株中的表达水平 Figure 3 SPRY4-IT1 expression level in ESCC cell lines 图4 MTT检测干扰SPRY4-IT1组与对照组细胞增殖能力 Figure 4 Proliferation of KYSE30 cells transfected with si-NC or si-SPRY4-IT1 determined by MTT assay 图5 流式细胞检测细胞周期, 干扰SPRY4-IT1后细胞阻滞于G1~G0 期(**P<0.01) Figure 5 Cell cycle distribution detected by flow cytometry(**P<0.01) A: FCM result; B: Analysis of the apoptosis 图6流式细胞检测细胞凋亡率 (A) ,干扰 SPRY4-IT1 后细胞凋亡率 增加 (B) (**P<0.01) Figure 6 Cell apoptotic rate detected by flow cytometry (**P<0.01) 3 讨论 非编码RNA曾经一度被认为是没有功能的转录 "噪音" [13-14] .然而近年来越来越多的非编码 RNA 被发现在多种疾病中发挥重要的调控作用而备受 0 10 20 30 40 50 60 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 Cumulative survival Survival time(months) SPRY4-IT1 low expression SPRY4-IT1 high expression SPRY4-IT1 low expression-censored SPRY4-IT1 high expression-censored HET-1A KYSE-510 KYSE-30 KYSE-70s SPRY4-IT1 relative expression 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 6 24 48 72 96 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 Absorbance ( OD=490 nm ) si-NC si-SPRY4-IT1 Time(h) 70 60 50 40 30 20 10 0 Ratio of cell cycle G0/G1 S G2/M ** ** ** si-NC si-SPRY4-IT1 si-NC si-SPRY4-IT1 60 50 40 30 20 10 0 Apoptotic rate ( % ) PI 104 103 102 101 100 PI 104 103 102 101 100 100 101 102 103 104 100 101 102 103 104 si-NC si-SPRY4-IT1 ** B A 1014 关注, 成为研究的热点.目前对 microRNA 在肿瘤 中的功能和机制研究很多, 但是对 LncRNA 在肿瘤 中的作用研究尚处于起步阶段.已经发现一些长 链非编码 RNA 在肿瘤的发生发展中起到重要的调 控作用, 认为肿瘤中的一些异常表达的长链非编码 RNA对肿瘤的诊断、 治疗和判断预后都能起到重要作 用[ 15 ] .因此, 探寻食管鳞癌中异常表达的LncRNA并 分析其功能将有助于提高ESCC的诊疗水平, 改善预 后.本研究发现 ESCC 组织中 SPRY4-IT1 高表达明 显, 表达水平与肿瘤大小、 TNM分期有关, 而与分化程 度、 淋巴结转移、 患者年龄、 性别、 吸烟、 饮酒及肿瘤家 族史无关.高表达 SPRY4-IT1 者预后较低表达者 差.进一步在细胞中检测SPRY4-IT1表达水平, 发现 其在肿瘤细胞株中的表达水平明显高于正常食管上皮 细胞株.在KYSE30细胞株中干扰SPRY4-IT1的表达 后能通过阻滞细胞周期, 诱导细胞凋亡从而抑制ESCC 细胞的生长. 结果提示 SPRY4-IT1 在ESCC 的发生发展中发 挥癌基因的作用, 可能成为判断ESCC疾病分期和预 后的重要标记物.然而,病理资料分析未发现SPRY4-IT1的表达与淋巴结转移相关, 与其在黑色素 瘤中的报道不太一致.对此结果分析原因可能是因 为样本量较小存在偏倚, 还可能为同一LncRNA在不 同肿瘤中发挥的作用不同.需要扩大样本量及进一 步的细胞功能实验来验证. 作为抑癌基因 SPRY4 的内含子区转录产物, SPRY4-IT1 却表现为癌基因的特征.有报道SPRY4-IT1 并未调控其宿主基因 SPRY4 的表达, 其 作用机制需要进一步研究.随着分子生物学技术的 进步, 特别是分子筛选技术的发展为我们研究其内 在的作用机制提供思路.有报道[9] 一些线索可能为 揭示 SPRY4-IT1 的作用机制提供帮助: 原位杂交 (FISH) 显示SPRY4-IT1主要位于细胞质中, 与HULC 类似, 推测SPRY4-IT1可能与HULC一样能竞争性结 合microRNA, 从而解除microRNA对靶mRNA的抑制 作用[16] , 可以使用芯片筛查并用荧光素酶技术验证 SPRY4-IT1 调控的 miRNA; 而RNA 二级结构预测显 示SPRY4-IT1 的二级结构含有多个茎环和假结, 而 目前一些研究显示 LncRNA 的特殊二级结构可与蛋 白分子结合从而发挥生物学功能[17-18] , 如果用 RNA pull down技术寻找与其结合的蛋白质, 将有希望揭示 其促癌作用的内在机制. 总之, SPRY4-IT1表达水平与ESCC的肿瘤大小、 TNM分期及预后相关, 可以促进ESCC细胞的增殖, 有 可能作为食管鳞癌的诊断、 判断预后的分子标志物及 治疗的分子靶点, 其内在机制需要进一步研究. 参考文献 1 黄文涛,郭向前,戴甲培,等.MicroRNA,lncRNA与神经退行性疾病[J]. 生物化学与生物物理进展,2010,37(8):826-833. 2 Prensner JR, Chinnaiyan AM. 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长链非编码RNA SPRY4-IT1在食管鳞癌中的表达及 对细胞生长的影响* 谢海伟 陈仿军 朱斌曹刚金磊周国志 吕进曹秀峰 摘要 目的: 探讨长链非编码RNA SPRY4-IT1与食管鳞状细胞癌 (ESCC) 的临床病理及预后的相关性, 以及对细胞生长的 影响.方法: 收集2008年1月至2009 年12月南京医科大学附属南京医院肿瘤外科50 例ESCC手术切除标本 (包括癌组织和癌旁 组织) , 荧光实时定量 PCR (qRT-PCR) 检测 50 例ESCC 中SPRY4-IT1 的表达情况, 分析其与临床病理及预后的关系, 用小干扰 RNA (siRNA) 干扰SPRY4-IT1后MTT法检测其对细胞生长的影响, 流式细胞检测对细胞凋亡和周期的影响.结果: 45例(90%) 标本中SPRY4-IT1呈阳性表达, SPRY4-IT1在癌组织中的表达量显著高于癌旁组织 (t=5.377, P<0.01) .SPRY4-IT1的相对表达 水平与肿瘤大小、 临床分期相关 (P均<0.05) .SPRY4-IT1在ESCC细胞株中表达量高于正常食管上皮细胞.KYSE30细胞中干扰 SPRY4-IT1的表达后可明显减慢细胞生长, 阻滞细胞周期并促进细胞凋亡 (P<0.01) .结论: SPRY4-IT1在ESCC组织中显著高表 达, 并且能促进ESCC细胞生长, 可能成为ESCC诊断和判断预后的重要分子标记物. 关键词 食管鳞癌 长链非编码RNA SPRY4-IT1 增殖 凋亡 doi:10.3969/j.issn.1000-8179.20130707 · 基础研究 · Long non-coding RNA SPRY4-IT1 expression in esophageal squamous cell carcinoma and its effects on cell growth Haiwei XIE, Fangjun CHEN, Bin ZHU, Gang CAO, Lei JIN, Guozhi ZHOU, Jin LV, Xiufeng CAO Correspondence to: Xiufeng CAO; E-mail: cxf551101@sina.com Department of Surgical Oncology, Nanjing Hospital Affiliated to Nanjing Medical University, Nanjing 210006, China. This work was supported by the Young Scientist Funds of the National Natural Science Foundation of China (No. 81201881) and by the Nanjing City Committee of Science and Technology (No. 201108027). Abstract Objective: This study aimed to clarify the correlation of SPRY4-IT1 expression with the clinicopathological character- istics and prognosis of patients with esophageal squamous cell carcinoma (ESCC), as well as the role of SPRY4-IT1 in promoting ES- CC cell growth. Methods: Quantitative real-time polymerase chain reaction for SPRY4-IT1 expression was performed on 50 paired can- cerous and adjacent non-cancerous esophageal specimens. Small interfering RNA was used to suppress SPRY4-IT1 expression to fur- ther explore its role in tumor progression. Cell viability was tested in vitro by MTT assay (OD=490 nm), and cell apoptosis and cell cy- cle were investigated by flow cytometry. Results: We found markedly elevated SPRY4-IT1 expression in cancerous tissues compared with adjacent non-cancerous tissues (90%, P<0.01). Relative SPRY4-IT1 expression levels were correlated with some clinicopathologi- cal characteristics, such as tumor size (χ2 =5.333, P=0.021), elevated TNM (2009) stage classi?cation (χ2 =5.556, P=0.018), and de- creased overall survival rates (χ2 =5.296, P=0.021). SPRY4-IT1 expression level was not correlated with patient age, gender, smoking status, or alcohol consumption (all P>0.05). Further experiments showed that SPRY4-IT1 expression levels were significantly higher in three ESCC cell lines than in the normal human esophageal epithelial cell line Het-1A. In vitro assays of the ESCC cell line KYSE30 demonstrated that knockdown of SPRY4-IT1 expression by small interfering RNA reduced cell growth, mediated cell cycle arrest at the G0-G1 phase, and promoted cell apoptosis (all P<0.01). Conclusion: SPRY4-IT1 was overexpressed in ESCC tissues and ESCC cell lines and promoted the growth of ESCC cells. The dysregulated expression of long non-coding RNA SPRY4-IT1 may play an important role in the process of ESCC development and may be developed as a useful biomarker for the diagnosis and prognosis of ESCC. Keywords: esophageal squamous cell carcinoma, long non-coding RNA, SPRY4-IT1, proliferation, apoptosis 作者单位: 南京医科大学附属南京医院肿瘤外科(南京市210006) ? 本文课题受国家自然科学基金青年项目 (编号: 81201881) 和南京市科委科技发展项目 (编号: 201108027) 资助 通信作者: 曹秀峰 cxf551101@sina.com 非编码 RNAs (ncRNAs) 是不具有编码功能的 RNA 总称,根据其功能的不同,可分为看家型ncRNAs和调节型ncRNAs[1] .根据分子大小 (200 nt) 可分为短链ncRNA—主要为微小RNA (microRNA) 和1011 长链ncRNA[2] .LncRNA是近年来被广泛关注的新型 调节型 ncRNA.LncRNAs 已知在基因转录翻译、 细 胞分化、 表观遗传等生命活动中均发挥了重要的调 控作用[3-5] .目前越来越多的研究证实LncRNAs异常 表达与肿瘤的发生发展有关, 如高表达的 BANCR、 LSINCT5、 HULC 分别与黑色素瘤、 乳腺癌与卵巢癌、 肝癌的发生发展相关[6-8] .而LncRNA 调控食管癌进 展的功能及机制研究鲜见报道.有报道 LncRNA SPRY4-IT1 (Gene ID: AK024556) 在黑色素瘤中高表 达, 并且调控黑色素瘤细胞的生长和转移, 因此认定 为促癌因子[9] .本实验将探讨 SPRY4-IT1 在食管鳞 癌(ESCC) 组织中的表达与临床病理资料的关系, 并 进一步研究其在调控ESCC细胞生长中的功能. 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 病例资料 收集 2008 年1月至 2009 年12 月 南京医科大学附属南京医院肿瘤外科 50 例ESCC 手 术切除标本 (包括癌组织和癌旁组织) , 肿瘤长度 1.1~8.4 cm, 平均长度3.07 cm. 患者年龄33~84岁, 平均年龄59.04岁 (表1 ) . 所有患者均未行术前放化 疗, 均行根治性手术, 留取肿瘤组织及距肿瘤边缘>5 cm 的正常组织, 手术切除标本立即放入液氮保存, 而后 转入-80℃冰箱冻存.50 例标本均经病理诊断为食 管鳞状细胞癌, 按照第 7 版(2009 年) 食管癌 TNM 分 期标准进行临床分期.随访自术后截至 2012 年12 月31 日, 中位随访 37 (8~60) 个月, 2 例失访.本研 究获得南京医科大学附属南京医院伦理委员会批准 并签署知情同意书.人正常食管上皮细胞株Het-1A 购自美国标准菌种库 (Manassas, VA, USA) , KYSE510、 KYSE70s、 KYSE30 细胞系取自食管鳞癌 患者[10-11] , 由中国医学科学院肿瘤研究所刘芝华教 授保存[12] . 1.1.2 试剂与仪器 RPMI-1640 培养液、 胎牛血清 及optimum购自美国Gibco公司.SPRY4-IT1干扰序 列、阴性对照(NC)、 转染试剂lipofectamine 2000、 SPRY4-IT1引物、 GAPDH引物及Trizol由美国Invitro? gen 公司提供.RNA 逆转录试剂盒(DDR047A)、 qRT-PCR 试剂盒由大连TaKaRa 公司提供.ABI 7500 实时荧光定量PCR仪购自美国AB公司. 1.2 方法 1.2.1 RNA提取及实时荧光定量PCR (qRT-PCR) 用Trizol 法取50~100 mg 正确保存的冻存组织, 磨成 粉末状, 加1 mL Trizol, 再次研磨混匀后抽提RNA.细 胞中抽提 RNA 时, 每(1~5) *107 个细胞中加入 1 mL Trizol, 静置 5 min, 用1mL 枪头吹打均匀.抽提后的 RNA 使用分光光度计测定波长 260、 280 nm 的吸收 值, 计算 RNA 浓度并评估纯度, RNA 样品 A260/A280 在1.8~2.1 为合格.RNA 逆转录按照 TaKaRa 公司的 Prime-ScriptTM 逆转录试剂盒说明书指示两步法逆转 录成 cDNA.实时荧光定量 PCR 按照 SYBR Green 说 明书配制反应体系, 每个样本设 3 个副孔重复. SPRY4-IT1 上游引物为 5'-AGCCACATAAATTCAGC AGA-3', 下游引物为5'-CGATGTAGTAGGATTCC TTTCA-3'. 使用GAPDH 作为内参,上游引物为5'-GTCAACGGATTTGGTCTGTATT-3', 下游引物为5'-AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3'. 使用 2^-ΛΛct 法 计算 SPRY4-IT1 在癌组织相对于癌旁组织的表达 量, 相对表达量小于1认为是阴性, 反之认为是阳性. 1.2.2 细胞培养及转染 所有细胞均使用RPMI-1640 培养液 (含10%胎牛血清) , 5%CO2、 37℃、 相对湿度 90%条件下培养, KYSE30 细胞培养至对数生长期用 于细胞转染.3条SPRY4-IT1的干扰序列分别为: 467: 5'-CCCAGAATGTTGACAGCTGCCTCTT-3';491:5'-T GGAGGGTTATGGGAGCCTGTGAAT-3';594:5'-GCT TTCTGATTCCAAGGCCTATTAA-3'.以乱序的 nega? tive control (NC) 作为对照.转染前1天以5*105 个/孔 的密度接种 6 孔板.待细胞生长到 80%~90%融 合时转染.转染前 240 μL optimum 中加入 10 μL lipofectamine 2000, 混匀后静置 5 min, 随后按照说明 书取 SPRY4-IT1 干扰序列 50 nmoL 溶于 optimum 至250 μL, 室温静置20 min; 将6孔板中细胞清洗2次, 每孔 加入上述溶液500 μL.转染后6 h换成含10%胎牛血 清的RPMI-1640培养液继续培养48 h用于进一步实验. 表1 50例ESCC患者一般资料 Table 1 General information of 50 ESCC patients Category Gender Male Female Section Neck Upper thoracic Middle thoracic Lower thoracic TNM Ⅰ-Ⅱ Ⅲ-Ⅳ Differentiation High Middle Low Cases 34 16 2 10 24 14 32 18 16 22 12 Rate (%) 68.00 32.00 4.00 20.00 48.00 28.00 64.00 36.00 32.00 44.00 24.00 1012 1.2.3 MTT 法绘制细胞生长曲线 将转染 NC 和SPRY4-IT1 干扰序列后 48 h 的KYSE30 细胞分别以 5*103 /孔接种于 96 孔板, 于接种后 6、 24、 48、 72、 96 h 每组取 6 孔, 加入 MTT (四甲基偶氮唑蓝) 20 μL, 4 h 后去除培养基, 加入 150 μL DMSO (二甲基亚砜) , 平 板震荡器上震荡15 min.在96孔全波段酶标仪上测 定波长为490 nm的吸光度 (A) , 取6孔平均值为结果 (A 值) , 以时间为横轴, A 值为纵轴绘制细胞生长曲 线, si-RNA对KYSE30细胞的抑制率 (%) = (1-实验组 A值/对照组A值) *100%. 1.2.4 流式细胞仪检测细胞周期和凋亡 细胞转染 后48 h, 消化收获培养细胞, 1 000 r/m 离心 5 min, 弃 上清, 将细胞用冷的 PBS 洗涤 2 次, 重悬于 75%乙醇 并于-20℃固定过夜, 洗涤离心后加入含有10 μg/mL 溴化丙啶 (PI) 和0.1%RNase A的PBS液500 μL, 室温 避光染色30 min后上流式细胞仪测定细胞周期.检 测细胞凋亡时消化收集细胞, 洗涤后重悬于 200 μL 的结合缓冲液, 加入10 μL Annexin V-FTC和5 μL的PI轻轻混匀, 避光室温反应15 min, 再加入300 μL结 合缓冲液, 流式细胞仪测定细胞凋亡情况, 以百分数 表示凋亡率. 1.3 统计学分析 应用SPSS 18.0统计软件对实验数据进行统计分 析.定量资料采用独立样本 t 检验, 分类资料采用χ2 检验或 Fisher 精确概率法.将失访及至观察结束仍 存活的病例设为截尾数据, Kaplan-Meier和Log-rank 检验分析生存率差别.双侧检验P<0.05为差异有统 计学意义. 2 结果 2.1 SPRY4-IT1 在ESCC 中的表达及与临床病理特 征的关系 50 例样本中45 例SPRY4-IT1 呈阳性表达(90%) , 5 例呈阴性表达 (10%) .SPRY4-IT1 在癌 组织中的相对表达量见图 1, 显著高于癌旁组织 (t=5.377, P<0.01) .以SPRY4-IT1 相对表达量的中 位值 (6.16) 为界, 将50 例样本分为高低表达两组, SPRY4-IT1的表达水平和肿瘤大小、 临床病理分期密 切相关, 但与分化水平、 淋巴结转移、 年龄、 性别、 吸烟、 饮酒未见明显相关 (表2) .截至随访结束, 两组生 存率差异有统计学意义 (图2, Log-rank检验χ2 =5.296, P=0.021) . 2.2 SPRY4-IT1在ESCC细胞株中的表达 用qRT-PCR 检测SPRY4-IT1 在ESCC 细胞株KYSE510、 KYSE70s、 KYSE30及正常食管上皮细胞株 HET-1A 中的表达水平, 发现 SPRY4-IT1 在ESCC 细胞株中表达量均高于HET-1A(图3). 其中在KYSE30细胞株中表达量最高, 用SPRY4-IT1的干扰 序列转染 KYSE30 细胞, 检测序列 594 的干扰效率最 高,对SPRY4-IT1 抑制率达 (70.45±4.12) %, 其余两 条无明显干扰效率, 与文献报道一致[9] . 图1 SPRY4-IT1在癌组织中相对于癌旁组织的表达量 Figure 1 SPRY4-IT1 expression level in tumor tissues relative to adja? cent non-cancerous tissues 表2 SPRY4-IT1表达水平与临床病理因素之间的关系 例(%) Table 2 Association of SPRY4-IT1 expression level with clinicopatho? logic factors n (%) 80 70 60 50 40 30 20 10 0 SPRY4-IT1 relative expression 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49 No. of the samples Pathological factors Age(years) ≤59 >59 Gender Male Female Smoking status + - Alcohol consumption + _ Differention Low Middle High Tumor size(cm) <3 ≥3 Lymph node metastasis + - TNM stage Ⅰ, Ⅱ Ⅲ, Ⅳ High SPRY4-IT1 level(n=25) 9 (36.00) 16 (64.00) 16 (64.00) 9 (36.00) 12 (48.00) 13 (52.00) 11 (44.00) 14 (56.00) 7 (28.00) 11 (44.00) 7 (28.00) 6 (24.00) 19 (76.00) 14 (56.00) 11 (44.00) 12 (48.00) 13 (52.00) Low SPRY4-IT1 level(n=25) 13 (52.00) 12 (48.00) 18 (72.00) 7 (28.00) 11 (44.00) 14 (56.00) 9 (36.00) 16 (64.00) 5 (20.00) 11 (44.00) 9 (36.00) 14 (56.00) 11 (44.00) 8 (32.00) 17 (68.00) 20 (80.00) 5 (20.00) χ2 1.299 0.368 0.081 0.333 0.629 5.333 2.922 5.556 P 0.254 0.544 0.777 0.564 0.721 0.021 0.087 0.018 1013 2.3 MTT 检测干扰 SPRY4-IT1 对KYSE30 细胞增殖 能力的影响 SPRY4-IT1 的表达量和肿瘤大小相关, 表明 SPRY4-IT1有可能参与细胞生长的调节, 因此本研究 用MTT 检测转染 SPRY4-IT1 干扰序列对 KYSE30 细 胞生存活力的影响, 发现干扰 SPRY4-IT1 的表达后 KYSE30 细胞生长明显慢于对照组细胞 (图4) , 24 h 开始干扰SPRY4-IT1组细胞生长慢于对照组, 48 h抑 制率为36.66%, 96 h抑制率为48.89%. 2.4 干扰SPRY4-IT1对KYSE30细胞周期的影响 流式细胞仪检测细胞周期显示, si-SPRY4-IT1/ KYSE30 组与 si-NC/KYSE30 细胞比较, G0/G1 期细胞 由(52.36±4.98) %增加到 (62.18±5.34) % (P<0.01) , S 期细胞由 ( 30.16±2.76 ) %降为 ( 27.91±1.99 ) % ( P<0.01 ) , G2/M 期细胞由(17.03±1.87) % 降为(9.91±2.55) % ( P<0.01 ) , 提示细胞周期阻滞于G0/G1期 (图5) . 2.5 干扰SPRY4-IT1对KYSE30细胞凋亡的影响 流式细胞检测细胞凋亡分析, 获得由四个象限 组成的散点图 (图6) , 右上象限属于晚期凋亡细胞, 右下象限属于早期凋亡细胞, 右上象限和右下象限 的细胞百分比总和为凋亡率, 转染 si-SPRY4-IT1 组 凋亡细胞为 (36.10±1.99) %, 对照组为 (25.97±1.68) % (P<0.01) . 图2 SPRY4-IT1高表达组与低表达组生存率曲线 Figure 2 Cumulative survival rates of patients with high and low SPRY4-IT1 expression levels 图3 SPRY4-IT1在食管鳞癌细胞株中的表达水平 Figure 3 SPRY4-IT1 expression level in ESCC cell lines 图4 MTT检测干扰SPRY4-IT1组与对照组细胞增殖能力 Figure 4 Proliferation of KYSE30 cells transfected with si-NC or si-SPRY4-IT1 determined by MTT assay 图5 流式细胞检测细胞周期, 干扰SPRY4-IT1后细胞阻滞于G1~G0 期(**P<0.01) Figure 5 Cell cycle distribution detected by flow cytometry(**P<0.01) A: FCM result; B: Analysis of the apoptosis 图6流式细胞检测细胞凋亡率 (A) ,干扰 SPRY4-IT1 后细胞凋亡率 增加 (B) (**P<0.01) Figure 6 Cell apoptotic rate detected by flow cytometry (**P<0.01) 3 讨论 非编码RNA曾经一度被认为是没有功能的转录 "噪音" [13-14] .然而近年来越来越多的非编码 RNA 被发现在多种疾病中发挥重要的调控作用而备受 0 10 20 30 40 50 60 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 Cumulative survival Survival time(months) SPRY4-IT1 low expression SPRY4-IT1 high expression SPRY4-IT1 low expression-censored SPRY4-IT1 high expression-censored HET-1A KYSE-510 KYSE-30 KYSE-70s SPRY4-IT1 relative expression 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 6 24 48 72 96 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 Absorbance ( OD=490 nm ) si-NC si-SPRY4-IT1 Time(h) 70 60 50 40 30 20 10 0 Ratio of cell cycle G0/G1 S G2/M ** ** ** si-NC si-SPRY4-IT1 si-NC si-SPRY4-IT1 60 50 40 30 20 10 0 Apoptotic rate ( % ) PI 104 103 102 101 100 PI 104 103 102 101 100 100 101 102 103 104 100 101 102 103 104 si-NC si-SPRY4-IT1 ** B A 1014 关注, 成为研究的热点.目前对 microRNA 在肿瘤 中的功能和机制研究很多, 但是对 LncRNA 在肿瘤 中的作用研究尚处于起步阶段.已经发现一些长 链非编码 RNA 在肿瘤的发生发展中起到重要的调 控作用, 认为肿瘤中的一些异常表达的长链非编码 RNA对肿瘤的诊断、 治疗和判断预后都能起到重要作 用[ 15 ] .因此, 探寻食管鳞癌中异常表达的LncRNA并 分析其功能将有助于提高ESCC的诊疗水平, 改善预 后.本研究发现 ESCC 组织中 SPRY4-IT1 高表达明 显, 表达水平与肿瘤大小、 TNM分期有关, 而与分化程 度、 淋巴结转移、 患者年龄、 性别、 吸烟、 饮酒及肿瘤家 族史无关.高表达 SPRY4-IT1 者预后较低表达者 差.进一步在细胞中检测SPRY4-IT1表达水平, 发现 其在肿瘤细胞株中的表达水平明显高于正常食管上皮 细胞株.在KYSE30细胞株中干扰SPRY4-IT1的表达 后能通过阻滞细胞周期, 诱导细胞凋亡从而抑制ESCC 细胞的生长. 结果提示 SPRY4-IT1 在ESCC 的发生发展中发 挥癌基因的作用, 可能成为判断ESCC疾病分期和预 后的重要标记物.然而,病理资料分析未发现SPRY4-IT1的表达与淋巴结转移相关, 与其在黑色素 瘤中的报道不太一致.对此结果分析原因可能是因 为样本量较小存在偏倚, 还可能为同一LncRNA在不 同肿瘤中发挥的作用不同.需要扩大样本量及进一 步的细胞功能实验来验证. 作为抑癌基因 SPRY4 的内含子区转录产物, SPRY4-IT1 却表现为癌基因的特征.有报道SPRY4-IT1 并未调控其宿主基因 SPRY4 的表达, 其 作用机制需要进一步研究.随着分子生物学技术的 进步, 特别是分子筛选技术的发展为我们研究其内 在的作用机制提供思路.有报道[9] 一些线索可能为 揭示 SPRY4-IT1 的作用机制提供帮助: 原位杂交 (FISH) 显示SPRY4-IT1主要位于细胞质中, 与HULC 类似, 推测SPRY4-IT1可能与HULC一样能竞争性结 合microRNA, 从而解除microRNA对靶mRNA的抑制 作用[16] , 可以使用芯片筛查并用荧光素酶技术验证 SPRY4-IT1 调控的 miRNA; 而RNA 二级结构预测显 示SPRY4-IT1 的二级结构含有多个茎环和假结, 而 目前一些研究显示 LncRNA 的特殊二级结构可与蛋 白分子结合从而发挥生物学功能[17-18] , 如果用 RNA pull down技术寻找与其结合的蛋白质, 将有希望揭示 其促癌作用的内在机制. 总之, SPRY4-IT1表达水平与ESCC的肿瘤大小、 TNM分期及预后相关, 可以促进ESCC细胞的增殖, 有 可能作为食管鳞癌的诊断、 判断预后的分子标志物及 治疗的分子靶点, 其内在机制需要进一步研究. 参考文献 1 黄文涛,郭向前,戴甲培,等.MicroRNA,lncRNA与神经退行性疾病[J]. 生物化学与生物物理进展,2010,37(8):826-833. 2 Prensner JR, Chinnaiyan AM. 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