第24卷第6期2012年6月Vol. 24, No. 6 Jun., 2012 生命科学 Chinese Bulletin of Life Sciences 文章编号:1004-0374(2012)06-0543-06 长链非编码RNA生物学功能及其意义研究进展 王俊青,张彦洁,任建敏,许春娣,刘炳亚,朱正纲,周同* (上海交通大学医学院附属瑞金医院,上海 200025) 摘要:人类基因组 DNA 核苷酸序列中约 93% 能被转录为 RNA,其中仅 2% 的转录产物被翻译为蛋白质, 余下 98% 属于非编码 RNA(non-coding RNA, ncRNA).ncRNA 中长度超过 200 nt 的称为长链非编码 RNA (long non-coding RNA, LncRNA),长期以来 LncRNA 被认为是转录过程中的副产物而不具有生物学功能. 近年随着微小 RNA(microRNA, miRNA) 的研究进展,揭示了 ncRNA 在人类基因转录后调节、细胞生长、 分化、增殖中起着相当重要的作用.同时也提示,相比 miRNA,在细胞内转录比例更高的 LncRNA 具有极 其复杂而重要的生物学功能,并与人类疾病密切相关.结合 LncRNA 的表观遗传学功能及其病理生理意义 作一简述. 关键词 : 真核生物 ; 非编码 RNA ; 长链非编码 RNA ; 转录调控 ; 表观遗传 中图分类号 : Q522 文献标志码 : A The research progress on biological function and significance of long non-coding RNAs WANG Jun-Qing, ZHANG Yan-Jie, REN Jian-Min, XU Chun-Di, LIU Bing-Ya, ZHU Zheng-Gang, ZHOU Tong? (Ruijin Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai 200025, China) Abstract: Although 93% of human genome can be transcribed into RNAs, only 2% of these products can be translated into proteins. The rest of the 98% RNAs are called noncoding RNAs (ncRNAs), which has been thought as non-functional by-products of transcription. But in recent years, the research on microRNAs (miRNAs) revealed that ncRNAs play important roles in the regulation of post-transcription of human genome, cell growth, cell differentiation and cell proliferation. The ncRNAs, more than 200 nucleotides, are called long-noncoding RNAs (LncRNAs). Studies of LncRNAs found that they are transcribed much more than that of miRNAs in cells, and they have more complex biological functions than miRNAs as well. There is increasing evidence to indicate that LncRNAs may be related to human diseases. This review mainly outlines the epigenetics function of LncRNA and its pathophysiological significance in brief. Key words: eukaryote; non-coding RNA; long non-coding RNA; transcriptional?control; epigenetics 收稿日期:2012-03-19; 修回日期:2012-05-07 基金项目:国家自然科学基金项目(81070567,8117- 0383,81072012) *通信作者:E-mail: zhoutong_cn@hotmail.com 真核细胞生物基因组由庞大复杂的 DNA 序列 构成,通过转录成 RNA 表达和传递生物遗传信息. 根据转录产物的功能,RNA 可以分为编码蛋白质 的信使 RNA(messenger RNA, mRNA) 和无蛋白编码 功能的非编码 RNA(non-coding RNA, ncRNA).相比mRNA,ncRNA 不具备典型的启始密码子、启 动子保守区、终止密码子、开放阅读框及终止密码 子等特性.人类基因组 DNA 约93% 能被转录为 RNA,仅2% 被翻译成约 20 000 种蛋白转录产物, 余下 98% 均为编码能力极低或无编码功能的非编 码RNA[1-2] .ncRNA 中,除tRNA、rRNA 等为人熟 知外, 其余大量 ncRNA 一直被视做转录过程的"暗 物质"(dark matter) 而未受重视 [3] .根据 ncRNA 长?评述与综述 ? 生命科学 第24卷544 度,将ncRNA 分为小非编码 RNA 和长链非编码 RNA (long non-coding RNA, LncRNA),后者碱基组 成从 200 nt 到100 000 nt 不等 [4] .研究提示 ncRNA 在细胞发展和代谢方面扮演举足轻重的角色 [5-6] , 目前发现最小的功能性 ncRNA 为转录起始 RNA (transcription initiation RNA, tiRNA),仅18 nt [7] ,长度22 nt 的微小 RNA (microRNA 或miRNA) 则可作 为肿瘤抑制因子或促癌因子行使功能,由此提示 LncRNA 也具有重要病理生理功能 [8] . LncRNA 占ncRNA 的80%, 多由RNA 聚合酶II 转录.LncRNA 转录水平低于蛋白质编码基因, 具有组织特异性,既参与表观遗传、可变剪接、入 核转运等过程,也能以细胞微结构原件、小RNA 前体等发挥功能 [9] ,且其转录和功能失调可能参与 肿瘤发生 [10] .因此,对LncRNA 生物学功能及其 与疾病关系的深入研究可为临床提供新的思路和应 对策略. 1 LncRNA发现与概况 在miRNA 成为研究热点之前,X 染色体失活 特异性转录因子 (X-inactive-specific transcript, XIST) 和H19 印迹基因等经典 LncRNA 就已被发现 [11-12] . 根据 LncRNA 在基因组中与邻近基因的相对位置, 将LncRNA 分为基因间、基因内及与编码序列反义 三类.目前 LncRNA 的研究并不深入,LncRNA 的 定义也不像 miRNA 那样明确,长度大于 200 nt 的 非编码 RNA 序列在许多文献中被冠以大非编码 RNA (large non-coding RNA)、mRNA 样长链RNA (mRNA-like long RNA)、长链基因间 RNA (long inter- genic noncoding RNA,LincRNA) 或超保守转录区 域(transcribed ultraconserved regions, T-UCRs) 等称谓[13] ,其中相当一部分序列其实存在编码短小多 肽的功能 [14] .如将上述形式均纳入 LncRNA 范畴, 估计人类 LncRNA 达7000 至23 000 种. 2 LncRNA生物学作用机制 随着 LncRNA 功能逐步显现,其与靶点的作 用机制成为进一步的热点.早期认为原位调控是 LncRNA 作用的唯一机制,它通过招募形成染色质 修饰复合物而沉默邻近基因转录,例如 IGF2R 反义RNA (antisense of IGF2R RNA, AIR)、 XIST 等[15] . 而Hox 基因反义基因间 RNA (Hox antisense intergenic RNA, HOTAIR) 的发现提示 LncRNA 可能存在远程 调控.同源异型基因 (homeotic genes, HOX) 在细胞 增殖与定向分化中起关键作用,人类 Hox 基因簇约 含100 个ncRNA 基因[16] , 其中HOTAIR 定位于HOXC 基因座 12q13.13[17] .HOTAIR 的5' 端可招募 结合多梳蛋白抑制复合物 2 (polycomb repressive complex 2, PRC2),借助 PRC2 上三个 H3K27 甲基化 酶EZH2、SUZ12 和EED [18] ,使另一基因座 HOXD 上长约 40 kb 的序列转录沉默,从而在乳腺上皮细 胞内使细胞内转录倾向于胚胎成纤维细胞样表型. 超过 20% 的LncRNA 能够通过结合 PRC2 或其他 类似复合物发挥作用,提示 LncRNA 的远程调控机 制在生物体内广泛存在. 根据 LncRNA 自身结构和所结合靶位点的性 质,将LncRNA 的作用方式分为四类 : RNA-RNA 序列特异性识别 ; RNA-DNA 序列杂交 ;与RNA 构型相关功能 ; 与蛋白相关的功能.其作用机制分 述如下. 2.1 RNA-RNA序列特异性识别 LncRNA 中70% 来源于编码基因的反义序列, 因此通过同源序列直接识别,在RNA 间产生相互 作用的机制普遍存在.顺义和反义转录产物之间通 过直接识别进行调控,如调节失衡将引起病理性改 变.典型例子是血管发育异常的组织中 TIE-1 mRNA 和其反义 TIE1-AS LncRNA 转录的比例失调 [19] . 随着认识的深入,在真核生物中,ncRNA 显现出相 比mRNA 更为复杂的功能 [20] .近期发现一类称为 竞争性内源 RNA (competing endogenous RNA, ceRNA) 的LncRNA,将RNA-RNA 之间的相互作用提高到 了新的认识水平.目前对 ceRNA 功能观察提示, 编码和非编码 RNA 之间可通过相互调节,通过竞 争性结合相应的 miRNA,对该 miRNA 的后续转录 后调控作用发生有效的控制 [21] .ceRNA 与miRNA 的结合可阻碍 miRNA 作用于靶基因,进而保证相 应靶基因的转录后表达 [22-23] .Cesana 等[24] 在研究 人和鼠的骨骼肌分化过程中,发现了一种名为 linc- MD1 的LncRNA, 可与miR-135 及miR-133 分别特异性结合,进而保证这两者的靶基因,即肌细胞 增强因子2C(myocyte enhancer factor 2C, MEF2C) 及决定因子样蛋白 -1(mastermind-like 1, MAML1) 的表达,由此对人和鼠的成肌纤维细胞分化产生显 著影响. 2.2 RNA-RNA序列杂交 RNA-DNA 双联 / 三联体是碱基互补结合的一 种高级构型.例如,LncRNA 与二氢叶酸还原酶 (dihydrofolate reductase, DHFR) 基因启动子通过互 王俊青,等:长链非编码RNA生物学功能及其意义研究进展 第6期545 补序列结合成 RNA-DNA 三联复合物,阻碍转录因 子IIB 结合DHFR 启动子并抑制转录[25] .RNA- DNA 双联 / 三联体结构稳定,具有特异性,有学 者提出,根据基因序列能够预测相应编码基因转 录水平.然而,在不同成纤维细胞株中,同一基因 失活水平并不均衡 [26] ,提示 LncRNA 双联 / 三联体 形成机制尚无法用单纯的基因序列互补进行解释. 2.3 与RNA构型相关功能 有别于短序列 ncRNA, LncRNA 具有更为复杂 的二级和三级结构.LncRNA 分子可通过碱基互补 形成茎环结构,复杂的二级结构赋予 LncRNA 特 殊的结合功能.如LnRNA repA 通过形成带有 4 个 发夹结构的二聚体才能与 PRC2 结合 [27] ; LncRNA Gas5 的发夹结构诱导糖皮质激素受体远离它在 DNA 上的靶位点,如发夹缺失,Gas5 与DNA 的 结合和转录抑制功能将受到糖皮质激素的影响 [28] . 不同物种中存在大量功能相似,但序列上无保守性 的LnRNA,例如人 Alu 和鼠 B2 可以通过形成相似 的二级结构阻止 RNA 聚合酶 II 与转录起始位点结 合, 提示二级结构具有决定 LncRNA 功能的作用 [29] . 2.4 与蛋白质相关的功能 已知人类的蛋白质中 1/4 的分子具有核苷酸结 合结构域 [30] .例如核非均一核糖核蛋白 A2 具有 RNA 和DNA 结合结构域, 在细胞有丝分裂过程中, 能够同时结合端粒酶 RNA 和末端着丝位点重复 DNA 片段 (telomitic duplicate DNA segment)[31] .然 而在这一领域,是否存在 LncRNA 与蛋白结合以及 LncRNA 在其中所发挥的功能尚不明确,推测蛋白 可作为连接体与LncRNA 和靶基因结合, 介导LncRNA 的调控作用. 3 LncRNA和表观遗传学调控的相互影响 表观遗传 (epigenetics) 指在基因组 DNA 序列 不发生改变的情况下,基因表达发生可遗传改变, 该现象普遍存在于动植物中,包括 DNA 甲基化、 组蛋白修饰、基因组印迹、随机染色体失活及 ncRNA 的调节作用等.LncRNA 的功能往往受到表 观遗传作用的影响, 同时 LncRNA 通过基因组印迹、 剂量补偿效应、染色质修饰等过程,在基因的表达 中发挥表观遗传学作用 [32] . 3.1 LncRNA基因转录与基因组印迹 基因组印迹是表观遗传学重要内容,表现为来 自父母双方的等位基因在遗传给子代时发生 DNA 甲基化、组蛋白乙酰化、组蛋白甲基化等修饰形成 基因组印迹,使带有印迹修饰的子代等位基因呈现 不同的转录活性,最终导致其中一方功能表达上 保持沉默.印迹基因通常以基因簇形式存在,形 成印迹区 (imprinted region),印迹区基因转录活性 受差异性甲基化区域 (differentially methylated regions, DMRs),即印迹中心 (imprinting centers, ICs) 调控. 1 个印迹区内至少存在 1 个非编码 RNA 基因,其中LncRNA 基因出现频率高 [33] ,提示 LncRNA 基 因转录受基因组印迹调控. 印迹区 LncRNA H19 与胰岛素样生长因子 2 (insulin-like growth factor 2, IGF2) 反义,是miRNA-675 前体, 呈母源表达 [34] . 胚胎组织中 H19 转录水平高, 出生后下调.在结肠癌,H19 转录因基因座印迹 丢失而上调,导致 miRNA-675 上调,由于在结直 肠肿瘤中 miRNA-675 下调肿瘤抑制因子 RB1 的 表达,因此 H19 的上调提示了它的促癌作用.相反 Leighton 等[35] 在缺乏 H19 的小鼠畸胎瘤模型中发 现了胚胎生长快速的现象,又提示了 H19 的抑癌作 用.由此推断 H19 存在双向调节功能. 3.2 LncRNA与剂量补偿效应 剂量补偿效应 (dosage compensation effect),是 具有 X、Y 性别决定机制的生物体内,调控性连锁 基因在两种性别里以相对相等的剂量进行有效表达 的遗传学机制. 哺乳动物中剂量补偿效应普遍存在, 表现为雌性个体细胞同型配子 (XX) 中1条染色体 失活,其上等位基因完全沉默.该过程由 X 染色体 上失活中心 (X-inactivation center, Xic) 控制,Xic 缺 失将中止 X 染色体失活.LncRNA 基因 Xist 定位于 Xic,能通过和 HOTAIR 相似的机制,招募并结合 PRC2介导基因沉默. Xist由拟失活的X染色体转录, 随之附着于该条 X 染色体,招募 DNA 甲基化酶 和组蛋白去乙酰化酶,通过染色体修饰,使之固缩 为异染色质,导致基因沉默.Xist 的反义转录产物 Tsix 对Xist 起负调控作用,阻止染色体失活.此外 增强子相 关Xite 和上 游Jpx 及Ftx[36-38] 等也参与 Xist 的调控. 4 LncRNA的病理生理意义 4.1 LncRNA与人类疾病 HOTAIR 在乳腺癌中作为判断预后和转移独立 指标的发现 [39] ,使人们将疾病机理研究的目光转 向LncRNA,并发现 LncRNA 与如阿尔兹海默症、 银屑病、脊髓小脑共济失调 8 型(spinocerebellat ataxia type 8, SCA8)[40-42] 等众多疾病相关. 生命科学 第24卷546 在先天性畸形中,过去认为 FOXL2 基因突变 是睑裂狭小综合征的病因,而距该基因 283 kb 处发 现的 LncRNA PISRT1 缺失现象提示除 FOXL2 因素 外,LncRNA 失调是该病发生的重要原因之一.手 足裂畸形的发生与编码蛋白 DlX5 和DLX6 转录活 化相关,研究发现上述蛋白的转录活化和上调是由 LncRNA EVF2 招募转录因子 Dlx2 而实现 [43] . 神经系统疾病同样涉及 LncRNA.阿尔兹海默 症研究发现 70% 的患者脑组织中 LncRNA BC200 下调,同时观察到 BC200 失调与脆性 X 综合征发 病有关. 在另一关于阿尔兹海默症的研究中, Faghihi 等[40] 发现反义产物 LncRNA β- 分泌性酶基 因反义链 (β-site APP-clerving enzyme 1-antisense RNA, BACE1-AS) 通过与β- 分泌性酶基因(β-site APP- clerving enzyme 1, BACE1) 结合增加 BACE1 mRNA 稳定性,使后者加速阿尔兹海默症发展.而在 SCA8 中,多聚谷氨酸蛋白 KLHL1 的反义 LncRNA 共济失调蛋白 8 反义链 (ataxin 8 opppsite strand, ATXN- 8OS) 转录上调是促进疾病发展的重要因素. 心血管疾病方面 LncRNA ANRIL 与冠心病发 生有关,该基因定位于 9p21,调控邻近基因 Cdkn2A 和Cdkn2AB 的转录,ANRIL 的失调引起心肌细胞 增殖异常和冠脉疾病 [44] . 4.2 LncRNA与人类肿瘤 随着分子肿瘤学研究的深入,人们发现 Lnc- RNA 涉及白血病、前列腺癌、乳腺癌、肝细胞癌、 结肠癌等多种肿瘤的发生 [45-49] . 例如肿瘤抑制基因 p15 的反义 LncRNA 能通 过调控 p15 基因甲基化水平促进白血病发生 [50] ; 同 时至少有 5 种以上 LncRNA 能与双链 DNA 结合蛋 白(the dsDNA-bingding protein, PSF) 结合并致其失 活,而由于 PSF 具有沉默原癌基因 GAGE6 的功能, 由此 LncRNA 与PSF 的结合,间接上调了 GAGE6, 促进了肿瘤的发生 [51] . 又如转移相关性肺腺癌转录子 1 (metastasis- associated lung adenocarcinoma transcript 1, MALAT1) 基因,其定位于染色体 11q13.1,MALAT1 能锚定 于染色质易位断裂点促进肿瘤侵袭和肿瘤细胞转 移[52] .体外实验敲除 MALAT1 功能后发现肺腺癌 细胞迁移能力受到抑制 [53] .同样,在子宫颈癌细胞 中敲除 MALAT1 后肿瘤增殖受到抑制 [54] . 研究显示,在前列腺癌中 LncRNA PlncRNA-1 与雄激素受体之间存在相互调节,PlncRNA-1 能上 调雄激素受体基因转录、促进细胞增殖 [55] ,这为前 列腺癌的靶向治疗提供了依据. LncRNA 中也存在抑制肿瘤的成员.母源表达 基因 3 (maternally expressed gene 3, MEG3) 是最早 被发现具有肿瘤抑制作用的 LncRNA,已发现 12 个MEG3 亚型 [56] .MEG3 基因转录来自父源印迹, MEG3 调控区超甲基化导致 MEG3 转录失活.MEG3 存在 3 种二级结构, M1~M3.借助二级结构的功能, MEG3 介导抑癌基因 p53 转录活化.多数正常组织 细胞具有 MEG3 转录活性,脑和脑垂体中转录活性 最高 [57] ,在多种人类恶性肿瘤细胞株中 MEG3 转 录水平显著降低甚至无法检测. 5 总结与展望 近年来通过对非编码 RNA 在表观遗传学功能 上的研究,逐步揭示非编码 RNA 的重要生物学功 能.LncRNA 作为 ncRNA 中的重要组份,已成为 遗传性和分子生物学关注的新热点.目前 LncRNA 的研究尚在初级阶段,研究发现 LncRNA 受到基因 组印记的调控,并与之存在复杂的网络调控关系, 同时 LncRNA 表观遗传机制介导了数量众多的编码 基因调控.值得关注的是,LncRNA 的特异性改变, 对上述机制产生影响显著,在研究人类疾病上具有 重要价值,尤其是在肿瘤学研究中,LncRNA 的意 义挖掘潜力巨大.目前虽已有肿瘤发生过程中具有 特征变化的 LncRNA 相关研究,然而它们所扮演的 角色和所起的特异性功能尚未明了.LncRNA 功能 复杂多样,既存在促进肿瘤发生发展的促癌因子, 也存在抑制肿瘤生长的抑癌因子,有的 LncRNA 促 进肿瘤远处转移和引起预后不良,也有的以 miRNA 前体形式改善肿瘤预后.相信随着 LncRNA 与肿瘤 发生的关系的阐明,LncRNA 将可能作为一类肿瘤 分子标记物或治疗靶点,为肿瘤的诊断和治疗提供 新契机. [参考文献] [1] Ponting CP, Belgard TG. Transcribed dark matter: meaning or myth? Hum Mol Genet, 2010, 19(R2): R162-8 [2] Carninci P, Kasukawa T, Katayama S, et al. The transcrip- tional landscape of the mammalian genome. 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第24卷第6期2012年6月Vol. 24, No. 6 Jun., 2012 生命科学 Chinese Bulletin of Life Sciences 文章编号:1004-0374(2012)06-0543-06 长链非编码RNA生物学功能及其意义研究进展 王俊青,张彦洁,任建敏,许春娣,刘炳亚,朱正纲,周同* (上海交通大学医学院附属瑞金医院,上海 200025) 摘要:人类基因组 DNA 核苷酸序列中约 93% 能被转录为 RNA,其中仅 2% 的转录产物被翻译为蛋白质, 余下 98% 属于非编码 RNA(non-coding RNA, ncRNA).ncRNA 中长度超过 200 nt 的称为长链非编码 RNA (long non-coding RNA, LncRNA),长期以来 LncRNA 被认为是转录过程中的副产物而不具有生物学功能. 近年随着微小 RNA(microRNA, miRNA) 的研究进展,揭示了 ncRNA 在人类基因转录后调节、细胞生长、 分化、增殖中起着相当重要的作用.同时也提示,相比 miRNA,在细胞内转录比例更高的 LncRNA 具有极 其复杂而重要的生物学功能,并与人类疾病密切相关.结合 LncRNA 的表观遗传学功能及其病理生理意义 作一简述. 关键词 : 真核生物 ; 非编码 RNA ; 长链非编码 RNA ; 转录调控 ; 表观遗传 中图分类号 : Q522 文献标志码 : A The research progress on biological function and significance of long non-coding RNAs WANG Jun-Qing, ZHANG Yan-Jie, REN Jian-Min, XU Chun-Di, LIU Bing-Ya, ZHU Zheng-Gang, ZHOU Tong? (Ruijin Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai 200025, China) Abstract: Although 93% of human genome can be transcribed into RNAs, only 2% of these products can be translated into proteins. The rest of the 98% RNAs are called noncoding RNAs (ncRNAs), which has been thought as non-functional by-products of transcription. But in recent years, the research on microRNAs (miRNAs) revealed that ncRNAs play important roles in the regulation of post-transcription of human genome, cell growth, cell differentiation and cell proliferation. The ncRNAs, more than 200 nucleotides, are called long-noncoding RNAs (LncRNAs). Studies of LncRNAs found that they are transcribed much more than that of miRNAs in cells, and they have more complex biological functions than miRNAs as well. There is increasing evidence to indicate that LncRNAs may be related to human diseases. This review mainly outlines the epigenetics function of LncRNA and its pathophysiological significance in brief. Key words: eukaryote; non-coding RNA; long non-coding RNA; transcriptional?control; epigenetics 收稿日期:2012-03-19; 修回日期:2012-05-07 基金项目:国家自然科学基金项目(81070567,8117- 0383,81072012) *通信作者:E-mail: zhoutong_cn@hotmail.com 真核细胞生物基因组由庞大复杂的 DNA 序列 构成,通过转录成 RNA 表达和传递生物遗传信息. 根据转录产物的功能,RNA 可以分为编码蛋白质 的信使 RNA(messenger RNA, mRNA) 和无蛋白编码 功能的非编码 RNA(non-coding RNA, ncRNA).相比mRNA,ncRNA 不具备典型的启始密码子、启 动子保守区、终止密码子、开放阅读框及终止密码 子等特性.人类基因组 DNA 约93% 能被转录为 RNA,仅2% 被翻译成约 20 000 种蛋白转录产物, 余下 98% 均为编码能力极低或无编码功能的非编 码RNA[1-2] .ncRNA 中,除tRNA、rRNA 等为人熟 知外, 其余大量 ncRNA 一直被视做转录过程的"暗 物质"(dark matter) 而未受重视 [3] .根据 ncRNA 长?评述与综述 ? 生命科学 第24卷544 度,将ncRNA 分为小非编码 RNA 和长链非编码 RNA (long non-coding RNA, LncRNA),后者碱基组 成从 200 nt 到100 000 nt 不等 [4] .研究提示 ncRNA 在细胞发展和代谢方面扮演举足轻重的角色 [5-6] , 目前发现最小的功能性 ncRNA 为转录起始 RNA (transcription initiation RNA, tiRNA),仅18 nt [7] ,长度22 nt 的微小 RNA (microRNA 或miRNA) 则可作 为肿瘤抑制因子或促癌因子行使功能,由此提示 LncRNA 也具有重要病理生理功能 [8] . LncRNA 占ncRNA 的80%, 多由RNA 聚合酶II 转录.LncRNA 转录水平低于蛋白质编码基因, 具有组织特异性,既参与表观遗传、可变剪接、入 核转运等过程,也能以细胞微结构原件、小RNA 前体等发挥功能 [9] ,且其转录和功能失调可能参与 肿瘤发生 [10] .因此,对LncRNA 生物学功能及其 与疾病关系的深入研究可为临床提供新的思路和应 对策略. 1 LncRNA发现与概况 在miRNA 成为研究热点之前,X 染色体失活 特异性转录因子 (X-inactive-specific transcript, XIST) 和H19 印迹基因等经典 LncRNA 就已被发现 [11-12] . 根据 LncRNA 在基因组中与邻近基因的相对位置, 将LncRNA 分为基因间、基因内及与编码序列反义 三类.目前 LncRNA 的研究并不深入,LncRNA 的 定义也不像 miRNA 那样明确,长度大于 200 nt 的 非编码 RNA 序列在许多文献中被冠以大非编码 RNA (large non-coding RNA)、mRNA 样长链RNA (mRNA-like long RNA)、长链基因间 RNA (long inter- genic noncoding RNA,LincRNA) 或超保守转录区 域(transcribed ultraconserved regions, T-UCRs) 等称谓[13] ,其中相当一部分序列其实存在编码短小多 肽的功能 [14] .如将上述形式均纳入 LncRNA 范畴, 估计人类 LncRNA 达7000 至23 000 种. 2 LncRNA生物学作用机制 随着 LncRNA 功能逐步显现,其与靶点的作 用机制成为进一步的热点.早期认为原位调控是 LncRNA 作用的唯一机制,它通过招募形成染色质 修饰复合物而沉默邻近基因转录,例如 IGF2R 反义RNA (antisense of IGF2R RNA, AIR)、 XIST 等[15] . 而Hox 基因反义基因间 RNA (Hox antisense intergenic RNA, HOTAIR) 的发现提示 LncRNA 可能存在远程 调控.同源异型基因 (homeotic genes, HOX) 在细胞 增殖与定向分化中起关键作用,人类 Hox 基因簇约 含100 个ncRNA 基因[16] , 其中HOTAIR 定位于HOXC 基因座 12q13.13[17] .HOTAIR 的5' 端可招募 结合多梳蛋白抑制复合物 2 (polycomb repressive complex 2, PRC2),借助 PRC2 上三个 H3K27 甲基化 酶EZH2、SUZ12 和EED [18] ,使另一基因座 HOXD 上长约 40 kb 的序列转录沉默,从而在乳腺上皮细 胞内使细胞内转录倾向于胚胎成纤维细胞样表型. 超过 20% 的LncRNA 能够通过结合 PRC2 或其他 类似复合物发挥作用,提示 LncRNA 的远程调控机 制在生物体内广泛存在. 根据 LncRNA 自身结构和所结合靶位点的性 质,将LncRNA 的作用方式分为四类 : RNA-RNA 序列特异性识别 ; RNA-DNA 序列杂交 ;与RNA 构型相关功能 ; 与蛋白相关的功能.其作用机制分 述如下. 2.1 RNA-RNA序列特异性识别 LncRNA 中70% 来源于编码基因的反义序列, 因此通过同源序列直接识别,在RNA 间产生相互 作用的机制普遍存在.顺义和反义转录产物之间通 过直接识别进行调控,如调节失衡将引起病理性改 变.典型例子是血管发育异常的组织中 TIE-1 mRNA 和其反义 TIE1-AS LncRNA 转录的比例失调 [19] . 随着认识的深入,在真核生物中,ncRNA 显现出相 比mRNA 更为复杂的功能 [20] .近期发现一类称为 竞争性内源 RNA (competing endogenous RNA, ceRNA) 的LncRNA,将RNA-RNA 之间的相互作用提高到 了新的认识水平.目前对 ceRNA 功能观察提示, 编码和非编码 RNA 之间可通过相互调节,通过竞 争性结合相应的 miRNA,对该 miRNA 的后续转录 后调控作用发生有效的控制 [21] .ceRNA 与miRNA 的结合可阻碍 miRNA 作用于靶基因,进而保证相 应靶基因的转录后表达 [22-23] .Cesana 等[24] 在研究 人和鼠的骨骼肌分化过程中,发现了一种名为 linc- MD1 的LncRNA, 可与miR-135 及miR-133 分别特异性结合,进而保证这两者的靶基因,即肌细胞 增强因子2C(myocyte enhancer factor 2C, MEF2C) 及决定因子样蛋白 -1(mastermind-like 1, MAML1) 的表达,由此对人和鼠的成肌纤维细胞分化产生显 著影响. 2.2 RNA-RNA序列杂交 RNA-DNA 双联 / 三联体是碱基互补结合的一 种高级构型.例如,LncRNA 与二氢叶酸还原酶 (dihydrofolate reductase, DHFR) 基因启动子通过互 王俊青,等:长链非编码RNA生物学功能及其意义研究进展 第6期545 补序列结合成 RNA-DNA 三联复合物,阻碍转录因 子IIB 结合DHFR 启动子并抑制转录[25] .RNA- DNA 双联 / 三联体结构稳定,具有特异性,有学 者提出,根据基因序列能够预测相应编码基因转 录水平.然而,在不同成纤维细胞株中,同一基因 失活水平并不均衡 [26] ,提示 LncRNA 双联 / 三联体 形成机制尚无法用单纯的基因序列互补进行解释. 2.3 与RNA构型相关功能 有别于短序列 ncRNA, LncRNA 具有更为复杂 的二级和三级结构.LncRNA 分子可通过碱基互补 形成茎环结构,复杂的二级结构赋予 LncRNA 特 殊的结合功能.如LnRNA repA 通过形成带有 4 个 发夹结构的二聚体才能与 PRC2 结合 [27] ; LncRNA Gas5 的发夹结构诱导糖皮质激素受体远离它在 DNA 上的靶位点,如发夹缺失,Gas5 与DNA 的 结合和转录抑制功能将受到糖皮质激素的影响 [28] . 不同物种中存在大量功能相似,但序列上无保守性 的LnRNA,例如人 Alu 和鼠 B2 可以通过形成相似 的二级结构阻止 RNA 聚合酶 II 与转录起始位点结 合, 提示二级结构具有决定 LncRNA 功能的作用 [29] . 2.4 与蛋白质相关的功能 已知人类的蛋白质中 1/4 的分子具有核苷酸结 合结构域 [30] .例如核非均一核糖核蛋白 A2 具有 RNA 和DNA 结合结构域, 在细胞有丝分裂过程中, 能够同时结合端粒酶 RNA 和末端着丝位点重复 DNA 片段 (telomitic duplicate DNA segment)[31] .然 而在这一领域,是否存在 LncRNA 与蛋白结合以及 LncRNA 在其中所发挥的功能尚不明确,推测蛋白 可作为连接体与LncRNA 和靶基因结合, 介导LncRNA 的调控作用. 3 LncRNA和表观遗传学调控的相互影响 表观遗传 (epigenetics) 指在基因组 DNA 序列 不发生改变的情况下,基因表达发生可遗传改变, 该现象普遍存在于动植物中,包括 DNA 甲基化、 组蛋白修饰、基因组印迹、随机染色体失活及 ncRNA 的调节作用等.LncRNA 的功能往往受到表 观遗传作用的影响, 同时 LncRNA 通过基因组印迹、 剂量补偿效应、染色质修饰等过程,在基因的表达 中发挥表观遗传学作用 [32] . 3.1 LncRNA基因转录与基因组印迹 基因组印迹是表观遗传学重要内容,表现为来 自父母双方的等位基因在遗传给子代时发生 DNA 甲基化、组蛋白乙酰化、组蛋白甲基化等修饰形成 基因组印迹,使带有印迹修饰的子代等位基因呈现 不同的转录活性,最终导致其中一方功能表达上 保持沉默.印迹基因通常以基因簇形式存在,形 成印迹区 (imprinted region),印迹区基因转录活性 受差异性甲基化区域 (differentially methylated regions, DMRs),即印迹中心 (imprinting centers, ICs) 调控. 1 个印迹区内至少存在 1 个非编码 RNA 基因,其中LncRNA 基因出现频率高 [33] ,提示 LncRNA 基 因转录受基因组印迹调控. 印迹区 LncRNA H19 与胰岛素样生长因子 2 (insulin-like growth factor 2, IGF2) 反义,是miRNA-675 前体, 呈母源表达 [34] . 胚胎组织中 H19 转录水平高, 出生后下调.在结肠癌,H19 转录因基因座印迹 丢失而上调,导致 miRNA-675 上调,由于在结直 肠肿瘤中 miRNA-675 下调肿瘤抑制因子 RB1 的 表达,因此 H19 的上调提示了它的促癌作用.相反 Leighton 等[35] 在缺乏 H19 的小鼠畸胎瘤模型中发 现了胚胎生长快速的现象,又提示了 H19 的抑癌作 用.由此推断 H19 存在双向调节功能. 3.2 LncRNA与剂量补偿效应 剂量补偿效应 (dosage compensation effect),是 具有 X、Y 性别决定机制的生物体内,调控性连锁 基因在两种性别里以相对相等的剂量进行有效表达 的遗传学机制. 哺乳动物中剂量补偿效应普遍存在, 表现为雌性个体细胞同型配子 (XX) 中1条染色体 失活,其上等位基因完全沉默.该过程由 X 染色体 上失活中心 (X-inactivation center, Xic) 控制,Xic 缺 失将中止 X 染色体失活.LncRNA 基因 Xist 定位于 Xic,能通过和 HOTAIR 相似的机制,招募并结合 PRC2介导基因沉默. Xist由拟失活的X染色体转录, 随之附着于该条 X 染色体,招募 DNA 甲基化酶 和组蛋白去乙酰化酶,通过染色体修饰,使之固缩 为异染色质,导致基因沉默.Xist 的反义转录产物 Tsix 对Xist 起负调控作用,阻止染色体失活.此外 增强子相 关Xite 和上 游Jpx 及Ftx[36-38] 等也参与 Xist 的调控. 4 LncRNA的病理生理意义 4.1 LncRNA与人类疾病 HOTAIR 在乳腺癌中作为判断预后和转移独立 指标的发现 [39] ,使人们将疾病机理研究的目光转 向LncRNA,并发现 LncRNA 与如阿尔兹海默症、 银屑病、脊髓小脑共济失调 8 型(spinocerebellat ataxia type 8, SCA8)[40-42] 等众多疾病相关. 生命科学 第24卷546 在先天性畸形中,过去认为 FOXL2 基因突变 是睑裂狭小综合征的病因,而距该基因 283 kb 处发 现的 LncRNA PISRT1 缺失现象提示除 FOXL2 因素 外,LncRNA 失调是该病发生的重要原因之一.手 足裂畸形的发生与编码蛋白 DlX5 和DLX6 转录活 化相关,研究发现上述蛋白的转录活化和上调是由 LncRNA EVF2 招募转录因子 Dlx2 而实现 [43] . 神经系统疾病同样涉及 LncRNA.阿尔兹海默 症研究发现 70% 的患者脑组织中 LncRNA BC200 下调,同时观察到 BC200 失调与脆性 X 综合征发 病有关. 在另一关于阿尔兹海默症的研究中, Faghihi 等[40] 发现反义产物 LncRNA β- 分泌性酶基 因反义链 (β-site APP-clerving enzyme 1-antisense RNA, BACE1-AS) 通过与β- 分泌性酶基因(β-site APP- clerving enzyme 1, BACE1) 结合增加 BACE1 mRNA 稳定性,使后者加速阿尔兹海默症发展.而在 SCA8 中,多聚谷氨酸蛋白 KLHL1 的反义 LncRNA 共济失调蛋白 8 反义链 (ataxin 8 opppsite strand, ATXN- 8OS) 转录上调是促进疾病发展的重要因素. 心血管疾病方面 LncRNA ANRIL 与冠心病发 生有关,该基因定位于 9p21,调控邻近基因 Cdkn2A 和Cdkn2AB 的转录,ANRIL 的失调引起心肌细胞 增殖异常和冠脉疾病 [44] . 4.2 LncRNA与人类肿瘤 随着分子肿瘤学研究的深入,人们发现 Lnc- RNA 涉及白血病、前列腺癌、乳腺癌、肝细胞癌、 结肠癌等多种肿瘤的发生 [45-49] . 例如肿瘤抑制基因 p15 的反义 LncRNA 能通 过调控 p15 基因甲基化水平促进白血病发生 [50] ; 同 时至少有 5 种以上 LncRNA 能与双链 DNA 结合蛋 白(the dsDNA-bingding protein, PSF) 结合并致其失 活,而由于 PSF 具有沉默原癌基因 GAGE6 的功能, 由此 LncRNA 与PSF 的结合,间接上调了 GAGE6, 促进了肿瘤的发生 [51] . 又如转移相关性肺腺癌转录子 1 (metastasis- associated lung adenocarcinoma transcript 1, MALAT1) 基因,其定位于染色体 11q13.1,MALAT1 能锚定 于染色质易位断裂点促进肿瘤侵袭和肿瘤细胞转 移[52] .体外实验敲除 MALAT1 功能后发现肺腺癌 细胞迁移能力受到抑制 [53] .同样,在子宫颈癌细胞 中敲除 MALAT1 后肿瘤增殖受到抑制 [54] . 研究显示,在前列腺癌中 LncRNA PlncRNA-1 与雄激素受体之间存在相互调节,PlncRNA-1 能上 调雄激素受体基因转录、促进细胞增殖 [55] ,这为前 列腺癌的靶向治疗提供了依据. LncRNA 中也存在抑制肿瘤的成员.母源表达 基因 3 (maternally expressed gene 3, MEG3) 是最早 被发现具有肿瘤抑制作用的 LncRNA,已发现 12 个MEG3 亚型 [56] .MEG3 基因转录来自父源印迹, MEG3 调控区超甲基化导致 MEG3 转录失活.MEG3 存在 3 种二级结构, M1~M3.借助二级结构的功能, MEG3 介导抑癌基因 p53 转录活化.多数正常组织 细胞具有 MEG3 转录活性,脑和脑垂体中转录活性 最高 [57] ,在多种人类恶性肿瘤细胞株中 MEG3 转 录水平显著降低甚至无法检测. 5 总结与展望 近年来通过对非编码 RNA 在表观遗传学功能 上的研究,逐步揭示非编码 RNA 的重要生物学功 能.LncRNA 作为 ncRNA 中的重要组份,已成为 遗传性和分子生物学关注的新热点.目前 LncRNA 的研究尚在初级阶段,研究发现 LncRNA 受到基因 组印记的调控,并与之存在复杂的网络调控关系, 同时 LncRNA 表观遗传机制介导了数量众多的编码 基因调控.值得关注的是,LncRNA 的特异性改变, 对上述机制产生影响显著,在研究人类疾病上具有 重要价值,尤其是在肿瘤学研究中,LncRNA 的意 义挖掘潜力巨大.目前虽已有肿瘤发生过程中具有 特征变化的 LncRNA 相关研究,然而它们所扮演的 角色和所起的特异性功能尚未明了.LncRNA 功能 复杂多样,既存在促进肿瘤发生发展的促癌因子, 也存在抑制肿瘤生长的抑癌因子,有的 LncRNA 促 进肿瘤远处转移和引起预后不良,也有的以 miRNA 前体形式改善肿瘤预后.相信随着 LncRNA 与肿瘤 发生的关系的阐明,LncRNA 将可能作为一类肿瘤 分子标记物或治疗靶点,为肿瘤的诊断和治疗提供 新契机. [参考文献] [1] Ponting CP, Belgard TG. Transcribed dark matter: meaning or myth? Hum Mol Genet, 2010, 19(R2): R162-8 [2] Carninci P, Kasukawa T, Katayama S, et al. The transcrip- tional landscape of the mammalian genome. 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